加吾拉·阿不力孜 王鑫 李芙 白楊 姚海江 莫雨平 周源 許紅 毛穎秋 高譽珊 張偉 張忠 李志剛 薛衛(wèi)國

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觀察電針“百會”、“涌泉”兩穴對不同月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ淀粉樣沉淀及超微結構的影響

加吾拉·阿不力孜 王鑫 李芙 白楊 姚海江 莫雨平 周源 許紅 毛穎秋 高譽珊 張偉 張忠 李志剛 薛衛(wèi)國

目的 觀察電針“百會”、“涌泉”兩穴對5月齡和10月齡淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1(amyloid precursor protein/presenilin-1, APP/PS1)雙轉基因鼠海馬β淀粉樣蛋白(Amyloid β Protein, Aβ)沉積及超微結構的影響。方法 分別將4月齡和9月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠按隨機分配法分為模型組、電針組和藥物組，以相同月齡同窩陰性小鼠作為對照組，4月齡每組12只，9月齡每組11只。電針組取“百會”、“涌泉”兩穴，每次留針時間為15分鐘，隔日1次，治療5周；藥物組予多奈哌嗪片0.92 mL/g灌胃，取腦透射電鏡片并觀察。結果 5月齡透射電鏡結果顯示：在微血管、神經(jīng)元突觸及神經(jīng)元超微結構上對照組優(yōu)于模型組。10月齡透射電鏡結果顯示：模型組海馬出現(xiàn)Aβ淀粉樣沉淀——老年斑。結論 5月齡小鼠行為學出現(xiàn)阿爾茨海默病樣改變；10月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬出現(xiàn)老年斑；電針治療APP/PS1雙轉基因小鼠可能對海馬超微結構有保護作用。

阿爾茨海默癥； 淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1； 海馬； 超微結構； 電針

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)多發(fā)于老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，老年斑、神經(jīng)元纖維纏結和神經(jīng)元丟失為主要病理改變的進行性神經(jīng)變性疾病。β淀粉樣蛋白(Amyloid β Protein, Aβ)被認為是導致AD發(fā)病的重要原因[1]。淀粉樣肽瀑流學說：此項學說強調Aβ聚集在導致老年斑形成、突觸減少、神經(jīng)功能失調、神經(jīng)元死亡以及有臨床癥狀的癡呆上起到關鍵作用，聚集可形成神經(jīng)毒素的原纖維，并進而組成阿爾茨海默病的病理特征之一老年斑[2]。Aβ為生理條件下的正常代謝產(chǎn)物，不斷產(chǎn)生又迅速被清除，但當發(fā)生遺傳或環(huán)境因素變化導致如淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)和早老蛋白1(presenilin-1, PS1)或者PS2基因突變，導致Aβ產(chǎn)生增加沉積形成老年斑，即可誘發(fā)AD。課題組以有毒Aβ1-42在海馬的表達為切入點，研究電針對有毒Aβ1-42在海馬沉積的影響，探討電針對腦海馬宏觀和微觀結構的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性4月齡和9月齡APP/PS1雙轉基因小鼠分別為36只和33只，隨機分為模型組、藥物組和電針組，4月齡每組12只，9月齡每組11只。相同月齡同窩陰性小鼠分別12、11只作為對照組。實驗動物皆購自南京大學模式動物研究所，許可證編號：SYXK(蘇)2010-003，4月齡體重(31.8±3.5)g；10月齡體重(42.7±5.5)g。普通小鼠飼料單籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃。實驗過程中兩組電針組各死亡一只小鼠。

1.2 主要試劑與儀器

Hans-100A型韓式電針儀(南京濟生醫(yī)療有限公司)，華佗牌無菌針灸針(0.18 mm×13 mm)，Olympus BX5顯微鏡，日本尼康NIS-Elements圖像分析系統(tǒng)；JEM1230型透射電鏡(日本電子公司)。Abcam Aβ抗體(ab10148)，超敏試劑盒(兔)，DAB顯色試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液，戊二醛溶液，鵝酸，丙酮溶液，SPI樹脂套裝，硝酸鉛，檸檬酸鈉，醋酸雙氧鈾等。

1.3 針刺方法

電針組將小鼠以自制鼠袋固定，按照小鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學方法，取“百會”、“涌泉”兩穴。穴位與針具常規(guī)消毒后，刺入2～3 mm。在兩“涌泉”穴接HANs-100電針儀，采用疏密波，頻率為2/100 Hz，強度1 mA，以小鼠足趾收縮但不掙扎嘶叫為度。針刺時間為15分鐘，隔日1次，治療5周。對照組、模型組予相同規(guī)格鼠套束縛15分鐘，隔天1次，束縛5周，不予其他治療，藥物組予多奈哌嗪0.92 mL/g灌胃，鼠套束縛同對照組。

1.4 觀察指標及檢測方法

(1) 取材：兩組不同月齡的實驗動物經(jīng)5周治療至分別滿5月齡和10月齡左右后取材。以10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉。透射電鏡片：心臟灌注同上，取腦放入2.5%的戊二醛溶液固定2小時以上，4℃進行固定。(2) 磷酸緩沖液pH：7.2沖洗3次，每次10分鐘。(3) 1%鵝酸室溫固定2小時。(4) 雙蒸水沖洗3次，每次10分鐘。(5) 梯度丙酮脫水：50%—70%—80%—90%—100%，3次，各10分鐘。(6) 滲透：812環(huán)氧樹脂與100%丙酮1∶3滲透30分鐘；環(huán)氧樹脂與100%丙酮1∶1滲透30分鐘；環(huán)氧樹脂與100%丙酮3∶1滲透30分鐘；純812樹脂滲透120分鐘。(7) 純樹脂包埋(Epon812)聚合37℃ 16小時；45℃ 24小時；60℃ 48小時。(8) 修塊。(9) 半博切片；甲苯胺藍染色2分鐘，洗凈，光鏡下定位觀察。(10) 2%醋酸雙氧鈾染色25分鐘后，立即沖洗，待銅網(wǎng)干燥無水后，2%檸檬酸鉛染色5～7分鐘及使用新鮮制備的蒸餾水沖洗干凈。(11) 電鏡觀察：JEM-1230型透射電鏡觀察拍照。

2 結果

2.1 電針對不同月齡APP/PS1轉基因鼠海馬微血管超微結構的影響

5月齡小鼠海馬微血管(放大50000倍)：模型組血管基膜增厚，邊界模糊結構不清，基膜外出現(xiàn)小量不規(guī)則絮狀條形物，周圍組織排列疏松；電針組血管基膜結構較模型組完整層次清，血管周圍結構清晰，但排列不緊密，線粒體結構清晰；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹溶解，血管壁結構層次不清，周圍組織排列疏松；對照組血管基膜完整，結構層次清晰，周圍組織排列疏松。見圖1。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：黃色箭頭為血管壁；綠色箭頭為線粒體圖1 5月齡APP/PS1小鼠海馬微血管超微結構(×50000)

10月齡小鼠海馬微血管(放大20000倍)：模型組血管基膜邊界不清或溶解，基膜外出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀條形物，血管壁內(nèi)容物萎縮，血管內(nèi)壁輪廓不清或有贅生物，血管壁線粒體結構不清或溶解，血管周圍組織結構模糊，細胞排列疏松且結構不清，有次級溶酶體出現(xiàn)；電針組血管基膜完整，內(nèi)容物出現(xiàn)腫脹但結構清晰，血管壁線粒體結構清晰，可見部分線粒體嵴斷裂或溶解，血管內(nèi)壁出現(xiàn)少許贅生物結構不清，血管周圍局部出現(xiàn)次級溶酶體且部分溶解出現(xiàn)脂滴，周圍細胞出現(xiàn)溶解；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹結構不清清，血管壁線粒體嵴斷裂多呈空泡狀，血管壁周圍出現(xiàn)溶酶體并有溶解形成脂滴，周圍還出現(xiàn)不規(guī)則絮狀條形物；對照組血管基膜完整，線粒體結構層次清晰，血管周圍神經(jīng)氈結構層次清晰，細胞排列緊密有序。見圖2。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：黃色箭頭為血管壁；紅色箭頭為不規(guī)則絮狀條形物；綠色箭頭為線粒體；藍色箭頭為溶酶體；紫色箭頭為溶酶體中脂滴圖2 10月齡APP/PS1小鼠海馬微血管超微結構(×20000)

2.2 電針對不同月齡APP/PS1轉基因鼠海馬神經(jīng)氈超微結構的影響

5月齡海馬神經(jīng)氈結構(放大50000倍)：模型組神經(jīng)突觸的部分突觸前后膜及突觸間隙結構模糊不清或增寬，突觸小泡有所減少，突觸后致密物厚度減少或消失；電針組前后膜較清晰，間隙不明顯，突觸小泡較模型組有所增多，突觸后致密物厚度有所減?。凰幬锝M前后膜較清晰，間隙明顯且間距小，突觸小泡減少，突觸后致密物變薄。對照組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，其突觸前后膜及突觸間隙結構清晰，突觸前終末有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚度大。見圖3。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：藍色箭頭為線粒體；黃色箭頭為突觸后致密物質圖3 5月齡APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)氈超微結構(×50000)

10月齡海馬神經(jīng)氈結構(放大50000倍)：模型組出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，細胞內(nèi)容物結構溶解紊亂不清，突觸前后膜及突觸間隙結構模糊不清；電針組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，線粒體結構清晰，其突觸前后膜及突觸間隙結構較清晰，突觸前膜有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚適中，細胞排列疏松不規(guī)則。藥物組神經(jīng)氈出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，部分細胞內(nèi)容物溶解結構不清，線粒體嵴斷裂，部分呈空泡狀，突觸前后膜及突觸間隙結構模糊不清，突觸前膜突觸小泡減少，突觸后致密物厚度消失；對照組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，其突觸前后膜及突觸間隙結構清晰，突觸前膜有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚度大，線粒體結構完整。見圖4。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組 注：紅色箭頭為老年斑；藍色箭頭為線粒體；黃色箭頭為突觸后致密物質圖4 10月齡APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)氈超微結構(×50000)

2.3 電針對10月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬老年斑沉積的影響

10月齡APP/PS1雙轉基因小鼠模型組血管(放大5000倍)周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀結構，周圍有少量次級溶酶體，神經(jīng)氈結構不清；電針組血管基膜增厚，血管壁內(nèi)容物增厚，內(nèi)皮細胞線粒體呈空泡狀，周圍細胞出現(xiàn)次級溶酶體，神經(jīng)氈結構層次清晰；藥物組血管基膜略有增厚，周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀結構，周圍出現(xiàn)暗黑色顆粒，神經(jīng)氈結構不清；對照組血管基膜完整，血管周圍神經(jīng)氈結構層次清晰，線粒體結構完整，神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，結構清晰。見圖5。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：紅色箭頭為老年斑；白色箭頭為次級溶酶體圖5 10月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬超微結構(×5000)

3 討論

3.1 電針治療對不同月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬微血管超微結構的影響

腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積主要是由有毒Aβ聚集形成的，本實驗從5月齡APP/PS1雙轉基因小鼠透射電鏡片結果得出模型組小鼠在腦海馬微血管基膜增厚，血管壁內(nèi)容物腫脹、輪廓不清等不同程度的改變，這些表現(xiàn)可能是由于受體在轉運Aβ的過程中，有毒Aβ?lián)p傷了微血管壁的結構及功能，導致了轉運受體不能正常的將Aβ從腦內(nèi)轉運至腦外，使Aβ經(jīng)血腦屏障的向外轉運減少，導致有毒Aβ在腦內(nèi)濃度升高；血管基膜外的不規(guī)則絮狀物可能是有毒Aβ血管周圍沉積的表現(xiàn)，可能是老年斑形成的初始時期。10月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬透射電鏡片可以看出：模型組血管基膜不規(guī)則增厚，血管內(nèi)壁輪廓不清，血管周圍神經(jīng)氈出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀組織，這可能是Aβ的毒性在轉運過程中損傷了微血管壁結構及功能，導致Aβ經(jīng)血腦屏障向外轉運受阻，血管周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀物沉積——老年斑。

5月齡組電針組血管基膜結構較模型組完整層次清，血管周圍結構清晰，提示電針可能有保護腦海馬微血管結及功能的作用；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹溶解，血管壁結構層次不清，可能是因為Aβ的毒性損傷到了腦海馬微血管結構，影響到了血管功能，藥物沒有對腦組織結構起到保護作用；10月齡APP/PS1轉基因小鼠電針組可能是因為Aβ的毒性損傷到了血管結構及功能，導致血管內(nèi)容物腫脹變形，血管周圍局部出現(xiàn)次級溶酶體且部分溶解出現(xiàn)脂滴，可能是因為電針激活了神經(jīng)自噬系統(tǒng)[3]，出現(xiàn)大量溶酶體吞噬了有毒Aβ形成脂滴，可能提高了血管自我保護能力；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹結構不清，血管壁線粒體嵴斷裂多呈空泡狀，可能是因為Aβ的毒性損傷到了血管結構及功能，周圍還出現(xiàn)不規(guī)則絮狀條形物,可能是老年斑前體，提示藥物對海馬超微結構無明顯保護作用；對照組血管基膜完整，結構層次清晰，這表明APP/PS1同窩陰性鼠是良好的對照模型。

3.2 電針治療對不同月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬突觸超微結構的影響

電針對AD治療效應的發(fā)揮可能與減輕線粒體超微結構損傷，改善線粒體功能，進而改善能量代謝和腦功能有關。線粒體是細胞的能量加工廠，通過氧化磷酸化過程為細胞生命活動提供能量[4]。電針對AD治療效應的發(fā)揮可能與減輕線粒體超微結構損傷、降低Caspase-3、Caspase-9表達，抑制細胞凋亡線粒體途徑的級聯(lián)反應, 減少細胞凋亡有關[5]。電針能有效調整海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進突觸形態(tài)可塑性的發(fā)揮[6]。5月齡小鼠實驗透射電鏡結果模型組突觸前后膜及間隙不清、突觸小泡減少、突觸后膜致密物厚度減小；電針組前后膜較清晰，間隙不明顯，突觸小泡較模型組有所增多，這可能是電針治療可以提高腦內(nèi)乙酰膽堿的活性，可能提高了突觸間信號傳遞，減緩腦癡呆樣變的進程，對海馬突觸結構有保護和修復的作用；藥物組前后膜較間隙明顯減小，突觸小泡有所減少，突觸后致密物變薄，提示藥物沒有對突觸超微結構保護作用；10月齡鼠模型組血管基膜結構功能受損，導致神經(jīng)氈出現(xiàn)大片脂褐色顆粒，破壞了線粒體結構及功能，影響了線粒體—突觸能量傳遞，使得突觸結構及功能收到破壞；電針組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，結構明顯優(yōu)于模型組，可能是因為電針治療對突觸結構起到了保護作用。藥物組神經(jīng)氈出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，可能是老年斑的前體，部分細胞內(nèi)容物溶解結構不清，線粒體嵴斷裂，部分呈空泡狀，突觸前后膜及突觸間隙結構模糊不清，突觸小泡減少，突觸后致密物厚度消失，提示藥物對海馬突觸結構無保護作用；對照組神經(jīng)氈結構優(yōu)于較模型組，提示APP/PS1雙轉基因鼠是良好的陰性模型。

APP/PS1雙轉基因鼠模型是近來公認度較高的阿爾茨海默病模型[7]，其行為學改變和腦病理表現(xiàn)與阿爾茨海默病患者相似度高，本實驗以觀察不同月齡的APP/PS1雙轉基因鼠腦內(nèi)有毒Aβ1-42沉積隨月齡變化，以出現(xiàn)β淀粉樣蛋白沉積為主線，研究阿爾茨海默病發(fā)展及電針對其超微結構的影響。5月齡APP/PS1小鼠腦海馬未見老年斑形成；10月齡APP/PS1小鼠腦海馬區(qū)可見大片老年斑；不同月齡APP/PS1雙轉基因小鼠電針組海馬超微結構明顯優(yōu)于模型組和藥物組，表明電針可以延緩或阻斷5月齡和10月齡APP/PS1轉基因鼠腦超微結構的AD樣改變進程，延緩了Aβ淀粉樣蛋白沉積發(fā)展成老年斑的這一過程，起到保護腦海馬超微結構的作用。

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(本文編輯：黃凡)

Effect of electro-acupuncture intervention on hippocampus Aβ stain and ultrastructure in APP/PS1 double transgenic rats

Jiawula·Abulizi,WANGXin,LIFu,etal.

SchoolofAcupunture-moxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

LIZhi-gang,E-mail:lizhigang620@126.com;XUEWei-guo,E-mail:snowmanxue@163.com

Objective To observe the influence of electro-acupuncture(EA) at “Baihui”(GV20) and “Yongquan”(KI1) on hippocampal Aβ stain and ultrastructure in 5-month-old and 9-month-old APP/PS1 double transgenic rat. Methods 4-moth-old and 9-month-old APP/PS1 double transgenic rats were according to the random assignment method divided into model group, EA group and drug(AChE) group and drug group with 12 rats each in 4-month-old groups and 11 rats each in 9-month-old groups, and the same months old rats with brood recessive gene were set as control group. Treatment was applied to “Baihui”(GV20) and “Yongquan”(KI1) for 15 mins, once every 2 days for 5weeks; For the drug group,0.92 mL/g of acetylcholine enzyme was given by gavage, once a day. Rat brains were taken to make transmission electric lens for observation. Results On transmission electron microscopy (sem) results showed that in 5-month-old rats, the capillaries, synapses and ultrastructure of neurons in the control group were better than the model group. In 10-month-old rats, there was senile plaque in the model group. Conclusion Alzheimer's disease-like behavior appeared in 5-month-old rats. Senile plague in hippocampus appeared in 10-month-old APP/PS1 double transgenic rats. EA therapy might improve the hippocampus microstructure in APP/PS1 double transgenic rats.

Alzheimer’s disease; Amyloid precursor protein/presenilin-1; Hippocampus; Ultrastructure; Electro-acupuncture

國家自然科學基金(81273826)

100029北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院[加吾拉·阿不力孜(博士研究生)、王鑫(博士研究生)、李芙(碩士研究生)、白楊(碩士研究生)、姚海江(博士研究生)、莫雨平(博士研究生)、周源(碩士研究生)、李志剛、薛衛(wèi)國]，基礎醫(yī)學院(許紅、高譽珊、張忠)，科研實驗中心(毛穎秋、張偉)

加吾拉·阿不力孜(1986- )，2012級在讀博士研究生。研究方向：針刺手法及針刺干預中樞神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail: jack47656@hotmail.com

李志剛(1965- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：針刺手法及針刺干預中樞神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail: lizhigang620@126.com；薛衛(wèi)國(1968- )，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：針刺治療阿爾茨海默病的機制研究。E-mail: snowmanxue@163.com。李志剛和薛衛(wèi)國并列為本文通訊作者。

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.002

2014-12-08)