張 亞， 陳 露

(江蘇省無錫市第九人民醫(yī)院病理科， 江蘇 無錫 214000)

HPV16 E6蛋白表達作為宮頸上皮內(nèi)病變的癌變等級指標研究

張 亞， 陳 露

(江蘇省無錫市第九人民醫(yī)院病理科， 江蘇 無錫 214000)

目的:為了研究HPV16 E6蛋白表達程度對宮頸上皮內(nèi)病變程度的影響。探討蛋白表達與不同等級宮頸內(nèi)上皮病變關(guān)系。為預(yù)測宮頸癌前病變結(jié)局轉(zhuǎn)歸的方向探索分子的指標。方法:選取35例樣本，其中10例低度鱗狀上皮內(nèi)病變(CIN1)，15例高度鱗狀上皮內(nèi)病變(CIN2和CIN3)，和10例正常上皮細胞樣本。使用免疫組化方法進行檢測。結(jié)果:HPV16 E6I基因在12例病人中高度表達(34.3%)。HPV16 E6Ⅱ基因在10例病人中高度表達(28.6%)。在CIN病人其表達均高于正常組。差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在CIN1、CIN2/CIN3與正常組織之間無統(tǒng)計學意義上的差別。在CIN2/CIN3之間表達HPV16 E6I基因、HPV16 E6Ⅱ基因的表達有統(tǒng)計學意義上的差別。結(jié)論:HPV16 E6蛋白可試作為確立宮頸癌等級的分子指標。

宮頸癌; 宮頸上皮內(nèi)病變; 癌變等級; HPV16 E6蛋白

宮頸癌是全世界女性癌癥患者的主要死亡原因之一，宮頸上皮內(nèi)瘤變是宮頸癌前病變。在部分患者中，經(jīng)過10年左右的發(fā)展，可以演變?yōu)閷m頸癌。宮頸癌發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染相關(guān)，是發(fā)生宮頸癌的重要流行病學因素［1］。HPV16是世界范圍內(nèi)廣泛流行的HPV病毒，其對宮頸癌的貢獻率超過70%［2］，但技術(shù)限制是導(dǎo)致 HPV患病率被低估的主要原因。HPV基因組整合入宿主細胞，使其過度不規(guī)律表達病毒E6和E7癌蛋白，這是低度宮頸上皮內(nèi)病變向高度宮頸上皮內(nèi)病變和浸潤癌發(fā)展的關(guān)鍵［3］。從HPV開始感染到癌癥進展，病毒克服宿主的免疫抵抗，將HPV的DNA整合入宿主細胞基因組致使宿主細胞的合成分子改變。目前高危型HPV的主要兩種癌基因是E6與E7?；蛘鲜笶6與E7非正常表達，導(dǎo)致由病毒E2蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄控制中斷，嵌合入E6/E7宿主細胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性提高。目前E6與E7癌蛋白的功能已知:HPV E6蛋白促使抑癌蛋白p53降解增加。HPV E7蛋白使其他抑癌蛋白滅活［4］。這些作用干擾了細胞周期的控制，破壞了DNA修復(fù)［5］。盡管E6和E7蛋白對宮頸惡變的影響得到廣泛公認，對于臨床宮頸腫瘤的分子水平上的研究并不多。本研究免疫組化染色，檢測HPV E6蛋白的表達水平，了解其與宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織惡變程度的相關(guān)性，為研究癌變過程中的分子水平表達作深入的探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取婦科手術(shù)切除石蠟包埋組織35例，年齡25～75歲，平均年齡40.3±13.0歲。10例為低度鱗狀上皮內(nèi)病變(CIN1)，15例為高度鱗狀上皮內(nèi)病變(CIN2和CIN3)，平均年齡39.96±14.09歲。10例為正常上皮細胞樣本，平均年齡41.0±10.1歲。分期采用世界衛(wèi)生組織制定的分類標準，對病理組織進行診斷。

1.2 方法:HPV16 E6蛋白的檢測:使用北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供免疫組織化學試劑盒和DAB顯色盒。三組分別檢測HPV16 E6I和E6II蛋白標志物。HE染色觀察病理形態(tài)，免疫組化采用兩步法，操作嚴格按試劑盒說明進行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明封片，設(shè)立陰性對照。每張切片在400倍光鏡下選8個不同視野計數(shù)陽性細胞數(shù)。每個樣本的免疫組化實驗重復(fù)進行三次。樣本的蛋白表達水平(RQ值)用β－actin作內(nèi)參校正的delta－delta CT法計算，其與校準物的表達水平有關(guān)(RQ=1)，從正常組織得到的HPV的蛋白表達水平作為校準樣本。

1.3 統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。各項指標采用秩和檢驗或完全隨機多樣本的秩和檢驗進行分析。相關(guān)性用斯皮爾曼等級相關(guān)進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

蛋白表達水平分析:通過delta－delta CT法計算得出RQ值，在10例樣本中，所有研究蛋白表達水平提高(RQ＞1)，HPV16 E6I基因在12例病人中高度表達(34.3%)。HPV16 E6Ⅱ基因在10例病人中高度表達(28.6%)。研究蛋白表達提高的發(fā)生率如表1。

表1 各樣本組之間研究蛋白表達水平的提高 n(%)

兩組RQ值與病變類型的差別用完全隨機多樣本的秩和檢驗分析。在正常組織與低度病變組織中，各項RQ值無統(tǒng)計學意義上的差別(P＞0.05)，但在宮頸高度病變CIN2和CIN3中，研究蛋白表達水平有統(tǒng)計學意義上的差別(P＞0.05)，且E6Ⅱ表達水平比E6I更高(P＞0.05)，在同病人組之內(nèi)，E6I和E6Ⅱ表達水平無統(tǒng)計學意義上的差別(P＞0.05))，其他兩組(CIN1和正常組織)也無顯著差別。

3 討論

高危型HPV E6蛋白能與細胞內(nèi)野生型抑癌基因產(chǎn)物p53和E6相關(guān)蛋白(E6AP)特異性結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，經(jīng)過泛素途徑快速誘導(dǎo)p53失活和降解，其效應(yīng)等同于p53突變，導(dǎo)致宮頸組織生長失控和惡性轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)宮頸組織癌變。而通常認為HPV16病毒的感染快速而短暫。據(jù)估計90%的HPV感染在幾個月之內(nèi)會自然消退，HPV16的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)展的首要條件。

在本研究中，將近66%的病人，被檢測出HPV16蛋白，包括正常組織，這可能表明了存在未整合入宿主細胞的病毒。只存在兩個樣本病毒基因表達有缺失，這種情況表明仍存在有效的E2調(diào)節(jié)，因而感染可能會自然消失。

病毒整合入宿主基因組可能在癌變早期發(fā)生，在中等程度病變中，游離和整合的HPV16都有存在，其他幾項研究表明，這種現(xiàn)象在CIN1和CIN2患者中的發(fā)生率達83～93%［6］，在我們的研究里，病毒存在但未整合入宿主細胞的情況存在于CIN1和CIN2/CIN3中，無論病變程度，病毒DNA的混合整合狀態(tài)占宮頸上皮病變大多數(shù)，這種狀況用普通形態(tài)學檢查宮頸巴氏涂片也能發(fā)現(xiàn)。

［1］Baseman J G，Koutsky L A.The epidemiology of human papillomavirus infections［J］.Journal of Clinical Virology，2005，32:16～24.

［2］Clifford G，F(xiàn)ranceschi S，Diaz M，Munoz N，Villa LL.Chapter 3:HPV type－distribution in women with and without cervical neoplastic diseases［J］.Vaccine，2006，24:26～34.

［3］Dorota Pastuszak－Lewandoska，Anna Bartosin'ska－Dyc，Monika Migdalska－Sek，Karolina H.Czarnecka，Ewa Nawrot，Daria Doman'ska，Krzysztof Szy，Ewa Brzezian'ska.HPV16 E6*II gene expression in intraepithelial cervical lesions as an indicator of neoplastic grade:a pilot study［J］.Med Oncol，2014，31:842.

［4］Howley P M，Münger K，Romanczuk H，et al.Cellular targets of the oncoproteins encoded by the cancer associated human papillomaviruses［J］.Princess Takamatsu Symposia，1990，22:239～248.

［5］Fehrmann F，Laimins LA.Human papillomaviruses:targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation［J］.Oncogene，2003，22:5201～5207.

Expression of HPV16 E6 Protein in Cervical Intraepithelial Lesions as an Indicator of Neoplastic Grade

ZHANG Ya， CHEN Lu
(The Ninth People＇s Hospital of Wuxi，Jiangsu Wuxi214000，China)

Objective:To study the impact of the extent of HPV16 E6 protein expression on extent of cervical intraepithelial lesions，to investigate the relationship between protein expression and different levels of epithelial lesions within the cervix uteri，and to explore molecular indicator so as to predict the direction of the outcome of precancerous lesions of uterine cervix.Method:Selected 35 cases of samples，including 10 cases of low－grade squamous intraepithelial lesions(CIN1)，15 cases of high－grade squamous intraepithelial lesions(CIN2 and CIN3)and 10 cases of normal epithelial cells in the samples.Used immunohistochemical methods for detection.Result:HPV16 E6I genes were highly expressed in 12 patients(34.3%).HPV16 E6II genes were highly expressed in 10 patients(28.6%).Their expressions in CIN patients were higher than normal group.Differences were statistically significant(P＜0.05).There＇s no statistically significant difference between CIN1，CIN2/CIN3 and normal tissue.The expression differences of HPV16 E6I gene and HPV16 E6II gene between CIN2 and CIN3 were statistically significant.Conclusion:HPV16 E6 protein may be tried to be seen as molecular indicator for determination of cervical cancer level.

Cervical cancer; Cervical intraepithelial lesions; Carcinogenesis grade; HPV16 E6 protein

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.04.015

1006－6233(2015)04－0573－03