史剛剛　郝敬鵬　甘建琛

摘要：目的 探討Vasohibin-1在人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）共培養(yǎng)體系中對(duì)HUVECs的作用。方法 通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)評(píng)價(jià)Vasohibin-1對(duì)HUVECs的抑制作用；以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HUVECs凋亡率。結(jié)果 Vasohibin-1能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和HUVECs共培養(yǎng)體系中HUVECs增殖；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定顯示隨其濃度的增加HUVECs的凋亡率在逐漸增加。結(jié)論 Vasohibin-1能促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480與HUVECs共培養(yǎng)中HUVECs的凋亡。

關(guān)鍵詞：血管生成抑制因子-1；血管內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡

Abstract：Objective To study the mechanism of Vasohibin-1 on promoting the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） in colonic cancer cell line SW480 co-culture system. Methods Tetrazolium blue was used for the evaluation on proliferation inhibition of Vasohibin-1 in HUVECs；flow cytometry was used to determine the apoptosis rate.Results Vasohibin-1 can significantly inhibit HUVECs proliferation and promote its apoptosis in SW480 co-cultured system.Conclusion Vasohibin-1 can promote HUVECs apoptosis in colonic cancer cell co-cultured system.

Key words：Vasohibin-1；Vascular endothelial cells； Apoptosis

Vasohibin-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，文獻(xiàn)報(bào)道它在多種腫瘤組織中表達(dá)[1]。但是，尚未見其對(duì)結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究報(bào)道。因此，本研究建立人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）體外共培養(yǎng)體系，探討Vasohibin-1對(duì)結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480（武漢博士德生物工程有限公司）、HUVECs（天津市泌尿外科研究所）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、Vasohibin-1抗原（美國(guó)Santa Cruz公司）。Transwell遷移小室（直徑6mm，孔徑5μm，Corning公司）； Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BDpharmingen公司）。

1.2方法

1.2.1SW480細(xì)胞和HUVECs共培養(yǎng)體系的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和HUVECs，分別采用0.25%胰酶和0.02 %EDTA1∶1混合消化液進(jìn)行消化，加入DMEM培養(yǎng)基分別制備成1×105細(xì)胞/ml的SW480單細(xì)胞懸液和5×105細(xì)胞/ml的HUVECs單細(xì)胞懸液，將6孔板Transwell小室的下室接種HUVECs，上室接種SW480細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將Transwell板置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，建立共培養(yǎng)體系。

1.2.2 Vasohibin-1在共培養(yǎng)體系中對(duì)HUVECs的抑制作用 待下室HUVECs長(zhǎng)至75%～85%融合度時(shí)，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Vasohibin-1至所需濃度。Vasohibin-1的濃度分別為5、10、20、40、80、100μg/ml，陰性對(duì)照組加100μl培養(yǎng)基代替，陽(yáng)性對(duì)照組以貝伐單抗（終濃度30μg/ml），另設(shè)本底對(duì)照孔。待孵育48h后，棄去每孔的含藥血清，重新加入1ml不含血清的培養(yǎng)基，另加入MTT液（5mg/ml）20μl，培養(yǎng)箱中孵育4h，棄去液體，每孔加入二甲基亞砜150μl，震蕩溶解10min，酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度A值。計(jì)算HUVECs的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HUVECs凋亡 按1.2.2接種細(xì)胞，并給予相應(yīng)藥物。培養(yǎng)48h后，根據(jù)下述步驟采用Annexin V-FITC試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡：將下室HUVECs以胰酶-EDTA消化，收集細(xì)胞。每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)1×104細(xì)胞。以500μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC，輕微混勻；測(cè)定前加入5μl PI并置于暗處避光反應(yīng)15min。上機(jī)測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。以O(shè)ne-way ANOVA方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Vasohibin-1抑制HUVECs增殖 在培養(yǎng)48h時(shí)Vasohibin-1對(duì)HUVECs生長(zhǎng)抑制率隨著濃度的升高逐漸增加，見表1。

2.2 Vasohibin-1誘導(dǎo)HUVECs凋亡 Vasohibin-1處理48h后，隨其濃度的增加HUVECs的凋亡率在逐漸增加。在SW480與HUVECs共培養(yǎng)體系中，Vasohibin-1對(duì)HUVECs 細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，見表2。

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。近些年來(lái)，抗腫瘤血管生成的靶向治療逐漸成為一個(gè)新的治療方法，目前研究最多是針對(duì)VEGF-A的靶向治療，但臨床顯示其療效沒有預(yù)期理想，因此，仍需研究其他的靶點(diǎn)、靶向藥物。Vasohibin-1作為VEGF-A的一個(gè)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[2]。而且Vasohibin-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主調(diào)節(jié)因子[3]。因此，研究其對(duì)結(jié)腸癌腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能有重要意義。

目前有多種研究腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。包括將腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞從腫瘤組織分離后培養(yǎng)，其分離過(guò)程復(fù)雜，含量極少；還有條件培養(yǎng)基培養(yǎng)法，其操作簡(jiǎn)便、成本低，但是無(wú)法保證調(diào)節(jié)因子持續(xù)、有效地作用于對(duì)應(yīng)細(xì)胞；而體外模擬培養(yǎng)的半透膜分隔培養(yǎng)法是將腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞分隔培養(yǎng)，它們所分泌的調(diào)節(jié)因子可以通過(guò)半透膜的小孔持續(xù)有效地發(fā)揮作用，其更符合腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分泌可溶性因子間接作用的情況[4]。因此，我們選擇了Transwell雙層共培養(yǎng)法。

研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，Vasohibin-1能抑制HUVECs的增殖，促進(jìn)HUVECs的凋亡。因此，我們可以通過(guò)增加腫瘤組織中Vasohibin-1的含量來(lái)促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤血管的生成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。然而，我們僅僅初步探討了Vasohibin-1對(duì)結(jié)腸癌共培養(yǎng)體系中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞有凋亡作用，仍需更深入的研究其內(nèi)在機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Watanabe K，Hasegawa Y，Yamashita H，et al.Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis[J]. J Clin Invest，2004，114（7）：898-907.

[2]Kern K，Steurer M，Gastl G，et al. Vasohibin inhibits angiogenic sprouting in vitro and supports vascular maturation processes in vivo[J]. BMC Cancer，2009，9：284.

[3]Affara M， Sanders D， Araki H， et al. Vasohibin-1 is identified as a master-regulator of endothelial cell apoptosis using gene network analysis[J].BMC Genomics，2013，14：23.

[4]Upreti M1， Jamshidi-Parsian A， Koonce NA，et al. Tumor-Endothelial Cell Three-dimensional Spheroids： New Aspects to Enhance Radiation and Drug Therapeutics[J].Transl Oncol，2011，4（6）：365-376.

編輯/成森