齊 妍 崔雪玲 閆 青 吳 倩 柳忠輝 葛敬巖 (吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫系，長春 130021)

中性粒細胞是血液循環(huán)中數(shù)量最多的白細胞，是機體防御細菌和真菌等病原體重要的固有免疫細胞，具有吞噬、遷移及呼吸爆發(fā)等細胞功能［1］。活化的中性粒細胞可以通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量超氧陰離子及活性氧(Reactive oxygen species，ROS)造成微生物的損傷和死亡［2，3］。中性粒細胞還參與多種炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，近幾年通過調(diào)控中性粒細胞來減少炎癥反應(yīng)對機體損傷的相關(guān)研究逐漸增多。激活素A(Activin A)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)超家族的多功能免疫調(diào)節(jié)因子，激活素A 異常表達與炎性疾病密切相關(guān)［4］，已知多種免疫細胞可產(chǎn)生激活素A，包括單核巨噬細胞、肥大細胞及Th2 細胞等［5-7］。最近研究表明中性粒細胞也是激活素A 的主要來源細胞之一，炎癥活化中性粒細胞及巨噬細胞均可快速釋放大量的激活素A［8］，激活素A 又以自分泌/旁分泌形式調(diào)控巨噬細胞功能，但激活素A 能否以自分泌/旁分泌形式調(diào)控中性粒細胞活性，以及調(diào)控中性粒細胞的信號傳導機制，仍無確切報道。因此，本研究擬通過檢測中性粒細胞激活素受體表達(ActR)以及中性粒細胞活性，闡述激活素A 調(diào)控中性粒細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周，由吉林大學動物中心提供。

1.2 主要試劑 激活素A 購自R＆D 公司;Percoll購自GE Healthcare 公司;PE 標記Anti-Gr-1 購自ebioscience 公司;APC 標記Anti-ActRⅡA 購自R＆D公司;超氧化物檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.3 分離中性粒細胞 每只小鼠腹腔注射9%酪蛋白1 ml，第一次注射后24 h 重復注射一次同等劑量的酪蛋白，第二次注射后3 h 收集小鼠腹腔積液細胞。將收集好的細胞用冷PBS 洗滌3 次后，用含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至50 ml 培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h 后，收集懸浮細胞。將收集好的細胞(5 ×107ml-1)與100% Percoll 以1∶9的比例在超速離心管中混合，將混合液4℃，190 000 r/min 離心65 min，棄掉含有巨噬細胞和淋巴細胞的第一層液體，收集第二層液體中的細胞。將收集好的細胞用迪夫快速染色試劑染色觀察，并用流式細胞術(shù)檢測Gr-1+細胞，此方法分離的中性粒細胞純度大于90%。

1.4 免疫熒光細胞化學染色檢測ActRⅡA 及Gr-1表達 使用免疫熒光細胞化學染色檢測中性粒細胞激活素ⅡA 型受體(ActRⅡA)表達。將分離后的中性粒細胞用冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入兔抗ActRⅡA(1∶500)，4℃孵育過夜，冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入FITC 標記Anti-Rabbit-IgG、PE 標記Anti-Mouse-Gr-1 及DAPI，4℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS 液洗滌2 次，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。同型對照組加入兔IgG 代替兔抗ActRⅡA，PE 標記IgG 代替PE 標記Anti-Mouse-Gr-1 進行孵育。

1.5 流式細胞術(shù)檢測Gr-1 及ActRⅡA 表達 使用流式細胞術(shù)檢測Gr-1 及ActRⅡA 表達。將分離后的中性粒細胞用冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入100 μl 冷的FACS 液重懸，分別加入APC 標記Anti-Mouse-ActRⅡA 及PE 標記Anti-Mouse-Gr-1，4℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS 液洗滌2 次，300 μl FACS 液重懸細胞，流式細胞儀進行檢測，同型對照組加入APC 標記Mouse-IgG 及PE 標記Mouse-IgG。

1.6 Western blot 檢測激活素A 刺激后Smad3 表達 將分離好的中性粒細胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。收集細胞，分別加入蛋白裂解液［1% Triton X-100，500 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，4 μg/ml leupeptin，1 μg/ml aprotinin］，充分裂解后，離心取上清。蛋白通過SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，分別加入兔抗ActR ⅡA 抗體(1 ∶1 000)，兔抗Smad3 抗體(1 ∶500)，兔抗磷酸化Smad3(p-Smad3)抗體(1∶500)及兔抗GAPDH 抗體(1∶1 000)孵育，洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 孵育，最后加入ECL 試劑(ECLPlus;Amersham Pharmacia Biotech)，通過化學發(fā)光成像檢測目的蛋白。

1.7 檢測激活素A 刺激后中性粒細胞內(nèi)ROS 水平 利用熒光探針DCFH-DA 進行細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)檢測，DCFH-DA 本身無熒光，可被細胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，ROS 可將無熒光的DCFH 氧化生成有熒光的DCF，最后通過測定熒光強度從而檢測細胞內(nèi)ROS 水平。將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。去除細胞培養(yǎng)液，加入DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標儀檢測熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 檢測激活素A 刺激后O2-的產(chǎn)生 O2-的檢測使用超氧化物檢測試劑盒(分解水溶性四唑鹽，WST-1)。將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。去除細胞培養(yǎng)液，加入含有WST-1 的反應(yīng)液，37℃避光孵育5 min，使用酶標儀在450 nm測定吸光度值A(chǔ)。

1.9 檢測激活素A 刺激后NO 分泌水平 將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。收集上清，Griess 法檢測NO，將上清液與Griess 試劑［0.1% N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽，1%對氨基苯磺酸和2.5%磷酸］等體積混合，室溫孵育5 min。使用酶標儀在540 nm 測定吸光度值A(chǔ)。雙蒸水稀釋的亞硝酸鹽作為標準品，濃度從1～100 mmol/L。

1.10 激活素A 刺激后中性粒細胞吞噬活性 將分離好的中性粒細胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。加紅色熒光微球(Microspheres，Red Fluoresent)，37℃孵育1 h 后洗去未被吞噬的紅色熒光微球，收集細胞，流式細胞術(shù)檢測吞噬百分率。

2 結(jié)果

2.1 分離小鼠腹腔中性粒細胞 迪夫快速染色結(jié)果顯示用此方法得到的中性粒細胞純度＞90%(圖1A)，對分離后的細胞用PE 標記抗鼠Gr-1 與FITC標記抗鼠CD3 抗體雙染，結(jié)果顯示Gr-1+細胞占細胞總數(shù)＞99%(圖1B)。

2.2 中性粒細胞表達ActRⅡA 免疫熒光染色結(jié)果顯示中性粒細胞可以同時表達Gr-1 與ActRⅡA(圖2A)，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示中性粒細胞中Gr-1 與ActRⅡA 雙陽性細胞為41.14%(圖2B)。

圖1 小鼠腹腔中性粒細胞的分離Fig.1 Isolation of peritoneal neutrophils in mouse

圖2 ActRⅡA 在中性粒細胞的表達Fig.2 Expression of ActRⅡA on mouse neutrophils

圖3 激活素A 對中性粒細胞激活素信號蛋白Smad3 表達的影響Fig.3 Effects of activin A on expression of Smad3 in mouse neutrophils

2.3 激活素A 對中性粒細胞激活素信號蛋白Smad3 表達的影響 如圖3 所示，激活素A 刺激后，中性粒細胞p-Smad3 表達上調(diào)，Smad3 蛋白表達有所下降，該結(jié)果進一步表明，激活素A 可以作用于中性粒細胞并導致激活素信號傳導通路的活化。

圖4 激活素A 對中性粒細胞呼吸爆發(fā)的影響Fig.4 Effects of activin A on respiratory burst

圖5 激活素A 對中性粒細胞NO 分泌及吞噬作用的影響Fig.5 Up-regulation of activin A on production of NO and phagocytosis of mouse neutrophils

2.4 激活素A 對中性粒細胞呼吸爆發(fā)的影響 結(jié)果顯示，激活素A 可以增加中性粒細胞內(nèi)ROS(圖4A)及細胞外O2-的產(chǎn)生(圖4B)，該結(jié)果提示激活素A 可能通過激活中性粒細胞，增加中性粒細胞的耗氧量，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，提供中性粒細胞抗感染作用。

2.5 激活素A 促進中性粒細胞NO 分泌及吞噬能力 如圖5 所示，不同濃度的激活素A 均可以促進中性粒細胞產(chǎn)生NO，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示激活素A 可以明顯促進中性粒細胞對紅色熒光微球的吞噬。

3 討論

激活素A 是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可由多種免疫細胞產(chǎn)生，并對多種免疫細胞功能具有調(diào)節(jié)作用，最近有研究顯示TNF-α 可以通過p38 MAPK 信號通路刺激中性粒細胞分泌大量激活素A［8］，然而，這些由中性粒細胞分泌的激活素A 是否可以作用于中性粒細胞目前尚不明確。激活素受體屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶型受體，分為激活素Ⅰ型受體(AcRⅠ)及激活素Ⅱ型受體(ActRⅡ)。激活素首先與ActRⅡ結(jié)合形成復合體，導致ActRⅡ變構(gòu)，激活A(yù)ctRⅠ，進而引發(fā)細胞內(nèi)信號蛋白Smad 家族的級聯(lián)反應(yīng)，將信號傳導入細胞核內(nèi)［9］。Smad 蛋白家族中的Smad2、3 可以介導TGF-β 和激活素的信號傳遞，磷酸化Smad3 對激活素信號傳導具有極其重要的作用［10，11］。本研究通過免疫熒光細胞化學染色以及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，中性粒細胞標志物Gr-1 和ActRⅡA 可以共表達于中性粒細胞表面，而且激活素A 刺激中性粒細胞后可以上調(diào)激活素信號傳導蛋白Smad3 磷酸化，上述資料充分證明，中性粒細胞不僅可以產(chǎn)生激活素A，同時也是激活素A 作用的靶細胞，激活素A 可能通過自分泌/旁分泌形式調(diào)控中性粒細胞活性。

激活素A 在一些主要由中性粒細胞參與的疾病中表達升高［12，13］，然而激活素A 是否可以調(diào)節(jié)中性粒細胞活性，目前仍無確切證據(jù)。我們的研究結(jié)果表明，激活素A 對中性粒細胞多種功能均有調(diào)節(jié)作用。呼吸爆發(fā)是中性粒細胞發(fā)揮其功能的重要機制，激活素A 可以增加中性粒細胞內(nèi)ROS 及細胞外O2-的產(chǎn)生，使中性粒細胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)。此外，激活素A 還具有刺激中性粒細胞分泌NO，增強中性粒細胞的吞噬作用。

綜上所述，本研究證明激活素A 可以直接作用于中性粒細胞，并調(diào)節(jié)中性粒細胞多種功能，在中性粒細胞介導的炎癥應(yīng)答中可能具有重要意義。

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