楊大剛 王 眾 王惠群 孫誠誼 (貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550004)

Plk1 是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，有誘導(dǎo)DNA 合成、DNA 完整性的檢修及防止細(xì)胞凋亡的作用。Plk1 與中心體復(fù)制，紡錘體形成，染色體分離以及胞質(zhì)分裂等有絲分裂期過程密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞周期檢測點(diǎn)啟動時，Plk1 通過降解細(xì)胞周期抑制蛋白weel，促使細(xì)胞進(jìn)入新的細(xì)胞周期。當(dāng)Plk1 突變或受外源性刺激干預(yù)后會失去其在有絲分裂期的正常功能并可以誘發(fā)細(xì)胞分裂紊亂，促使細(xì)胞發(fā)生癌變。此外，Plk1 可以通過抑制人線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)，調(diào)節(jié)具有抗病毒、抗腫瘤功能的IFN(Interferon，IFN)的生成，破壞先天性免疫［1］，降低機(jī)體對腫瘤的抵抗作用。

細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1、2(Check point kinase 1/2，Chk1/2)作為細(xì)胞周期檢測中關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白激酶，主要以S 期和G2/M 期為主要調(diào)控點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞周期的正常時序。當(dāng)Chk1/2 表達(dá)異常時，引起基因組穩(wěn)定性下降、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此細(xì)胞周期檢測點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的機(jī)制密切相關(guān)［2］。相對應(yīng)的，當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到放化療殺傷，DNA 復(fù)制紊亂時，Chk1/2 也會幫助腫瘤細(xì)胞停止細(xì)胞周期進(jìn)程并修復(fù)損傷，使其逃避放化療的殺傷。本研究通過了解Plk1、Chk1/2 在原發(fā)性肝癌組織及HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)，以期為原發(fā)性肝癌的生物免疫治療治提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 組織來源 以手術(shù)切除并排除術(shù)前放、化療的病例資料完整的原發(fā)性肝癌石蠟標(biāo)本40 例。其中17 例為高、中分化，23 例為低分化;年齡:34～71歲，中位年齡48 歲。同時分別隨機(jī)選取正常肝組織及肝硬化組織標(biāo)本各8 例，該16 例組織標(biāo)本經(jīng)病理診斷排除腫瘤病變，所有組織標(biāo)本均由貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人Plk1 單克隆抗體、鼠抗人Chk1 單克隆抗體、鼠抗人Chk2 單克隆抗體及鼠單克隆β-actin 抗體均為美國Santa Cruz 公司生產(chǎn)。二步法免疫組化檢測試劑盒及DAB 顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測蛋白表達(dá) 采用Envision 免疫組化二步法染色，具體步驟按試劑盒說明操作。將石蠟包埋組織4 μm 厚切片，常規(guī)二甲苯梯度脫蠟，酒精梯度脫水，高壓抗原修復(fù)，以PBS 替代一抗作陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷 采用雙盲法閱片，在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，陽性細(xì)胞指細(xì)胞核和細(xì)胞漿含淺灰色或者灰色、深灰色顆粒者;陽性率指高倍鏡(×400)下計數(shù)5 個視野內(nèi)100 個細(xì)胞的平均陽性細(xì)胞率;蛋白表達(dá)的由弱至強(qiáng)依次為:黑色0 分、淺灰色1分、灰色2 分、(棕)深灰色3 分;平均陽性率＜10%計0 分，10%～24% 計1 分，25%～49%計2 分，50%～74%計3 分，≥75%計4 分。綜合判定:取著色強(qiáng)度和陽性率分?jǐn)?shù)之乘積:0 分記為(-)，1～2分記為(+)，3～4 分記為(++)，6～8 分記為(+++)，9～12分記為(++++);(-)和(+)判定為表達(dá)陰性，(++)～(++++)判定為陽性表達(dá)。

1.2.3 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細(xì)胞中表達(dá)的定性分析 采用Western blot 方法對Plk1、Chk1/2蛋白在HepG2 細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行定性分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。應(yīng)用Photoshop cs5.0 軟件測定每條條帶的平均灰度值和面積，并用平均灰度值減去背景灰度值所得的絕對灰度值×蛋白條帶所占面積作為目標(biāo)條帶的最終灰度值。以目標(biāo)蛋白和β-actin 蛋白最終灰度值相比所得的相對表達(dá)率為數(shù)據(jù)，檢驗不同基因蛋白表達(dá)的差異。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS19.00 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗，蛋白表達(dá)灰度值采用多組單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白的表達(dá) 如表1 及圖1 所示:40 例原發(fā)性肝癌組織中，Plk1、Chk1/2 的陽性例數(shù)分別為23 例、30 例和9 例，陽性表達(dá)率分別為57.5%、75.0% 和22.5%。16 例肝非腫瘤組織中Plk1、Chk1/2 的陽性分別為0 例、4 例和9 例，分別占總例數(shù)的0%，25.0%和56.3%。原發(fā)性肝癌組織中Plk1 和Chk1 表達(dá)陽性率均高于肝非腫瘤組織(P＜0.05)。而Chk2 在肝非腫瘤組織的表達(dá)高于在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)(P＜0.05)。

2.2 HepG2 細(xì)胞中Plk1、Chk1/2 蛋白表達(dá)情況。

2.2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)如圖2 所示，三種激酶蛋白在HepG2 細(xì)胞中均有表達(dá)。

2.2.2 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細(xì)胞中表達(dá)的半定量分析 如表2 所示，激活CDC25 磷脂酶，使細(xì)胞進(jìn)入M期，啟動有絲分裂［3，4］。其缺失可能導(dǎo)致出現(xiàn)多中心體、多核細(xì)胞，發(fā)生姐妹染色體分離障礙等與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的改變［5］。

表1 Plk1、Chk1/2 在原發(fā)性肝癌和肝非腫瘤組織中表達(dá)情況［n(%)］Tab.1 Expression of Plk1，Chk1/2 in primary liver cancer(PLC)and non-tumor liver tissue(NTL)［n(%)］

圖1 Plk1、Chk1/2 蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)(SP，×400)Fig.1 Expression of Plk1，Chk1/2 protein in primary liver cancer tissue(SP×400)

圖2 HepG2 細(xì)胞中Plk1、Chk1/2 蛋白的表達(dá)Fig.2 Plk1，Chk1/2 proteins expression in HepG2 cells

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白與β-actin 總灰度值比較及各基因蛋白相對表達(dá)量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白與β-actin 總灰度值比較及各基因蛋白相對表達(dá)量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

Note:Relative expression=grey value of the protein/grey value of β-actin.1)P＜0.05 compared with Plk1;2)P＜0.01 compared with Chk1，Plk1.

Chk1/2 位于細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激活途徑的末端，DNA 受到損傷時，Chk1/2 通過調(diào)控weel、14-3-3、CDC25 等相關(guān)蛋白，激活DNA 損傷檢測點(diǎn)，使細(xì)胞周期發(fā)生改變，滯留于G1/S、S 或G2/M 期，使受損DNA 自我修復(fù)［6］。

腫瘤細(xì)胞DNA 被破壞時，Chk1/2 可使其細(xì)胞周期暫停從而完成自我修復(fù)后逃避凋亡［7］。以Chk1/2 為作用靶點(diǎn)，可干擾腫瘤細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制，從而提高腫瘤治療的敏感性［8，9］。

3 討論

本研究結(jié)果顯示:Plk1、Chk1/2 激酶蛋白在原發(fā)性肝癌組織中均有表達(dá)，Plk1、Chk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)高于非腫瘤組織，而Chk2 在非腫瘤組織中的表達(dá)高于原發(fā)性肝癌組織，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。Plk1 的表達(dá)和以往所報道的其在大多數(shù)人類惡性實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)，并與某些腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后相一致［10，11］。近些年也有國內(nèi)外研究表明Chk1 在一些惡性腫瘤中表達(dá)［11，12］。結(jié)合本實(shí)驗結(jié)果可以說明Plk1 與Chk1 具有相對意義的腫瘤選擇性表達(dá)，且Plk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)率為57.5%，而在所有的非腫瘤組織中均無表達(dá);Chk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)率為75.0%，說明Plk1 與Chk1 可能是未來原發(fā)性肝癌治療的理想靶點(diǎn)。

Plkl、Chk1/2 蛋白在HepG2 細(xì)胞中均有表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度為Plk1 ＞Chk1 ＞Chk2。這一點(diǎn)驗證了這三種基因在原發(fā)性肝癌治療中Plk1 及Chk1 作為靶點(diǎn)的特異性。HepG2 為人肝癌細(xì)胞，生長增殖旺盛，故其多處于M 期，而Plk1 激酶正發(fā)揮著細(xì)胞從分裂間期進(jìn)入分裂期的“分子開關(guān)”作用。Chk1/2激酶作用于細(xì)胞分裂間期，故他們在HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)水平低于Plk1，而Chk2 的表達(dá)最低，但明確其與腫瘤發(fā)生之間的相互關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

Chk1 在細(xì)胞周期中的作用位置與Plk1 互補(bǔ)，幾乎作用于除M 期之外的G1 期、S 期、G2 期;Chk2則作用在G1 期與G2 期?？紤]到本實(shí)驗所研究的HepG2 細(xì)胞為人肝腫瘤細(xì)胞，處于對數(shù)生長期時分裂增殖數(shù)率很快，故其處于M 期的細(xì)胞數(shù)量較多，因此Plk1 在三種蛋白中的表達(dá)豐度最高。而Chk1是細(xì)胞處于細(xì)胞間期準(zhǔn)備階段的重要蛋白，可以說在細(xì)胞間期發(fā)揮著許多決定性作用，為腫瘤細(xì)胞的分裂增殖提供了生物學(xué)保證。本研究結(jié)果顯示Chk2 在肝非腫瘤組織中的表達(dá)率高于原發(fā)性肝癌組織，說明Chk2 可能參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程，但其并非是關(guān)鍵蛋白，其與原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚待探索。

［1］Vitour D，Dabo S，Ahmadi Pour M，et al.Polo-like kinase 1(PLKl)regulates IFN induction by MAVS［J］.J Biol Chem，2009，284(33):21797-21809.

［2］Colnaghi R，Wheatley SP.Liaisons between survivin and Plk1 during cell division and cell death［J］.J Biol Chem，2010，285(29):22592-22604.

［3］Anna Santamaria，Bin Wang，Sabine Elowe，et al.The Plk1-dependent Phosphoproteome of the Early Mitotic Spindle［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10(1):M110.004457.

［4］Leo Studach，Wen-Horng Wang，Gregory Weber，et al.Polo-like kinase 1 activated by the hepatitis B virus X protein attenuates both the DNA damage checkpoint and DNA repair resulting in Partial polyploidy［J］.J Biol Chem，2010，285(39):30282-30293.

［5］He ZL，He Zheng，Hui Lin，et al.Overexpression of polo-like kinase1 predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients［J］.World J Gastroenterol，2009，15(33):4177-4182.

［6］Hiroyuki Niida，Kazuhiro Murata，Midori Shimada，et al.Cooperative functions of Chk1 and Chk2 reduce tumour susceptibility in vivo［J］.EMBO J，2010，29(20):3558-3570.

［7］Matsumoto K，Nagahara T，Okano J，et al.The growth inhibition of hepatocellular and cholangiocellular carcinoma cells by gemcitabine and the roles of extracellular signal-regulated and checkpoint kinases［J］.Oncol Rep，2008，20(4):863-872.

［8］王玉祥，祝淑釵，封 巍.CHK1 和CHK2 shRNA 轉(zhuǎn)染對食管癌細(xì)胞照射后G2 期阻滯的影響［J］.中華腫瘤雜志，2006，28(8):572-577.

［9］Varmark H，Kwak S，Theurkauf WE.A role for Chk2 in DNA damage induced mitotic delays in human colorectal cancer cells［J］.Cell Cycle，2010，9(2):312-320.

［10］黃 偉，張瑤珍，周劍鋒，等.Chk1/2 反義寡核苷酸對順鉑作用下K562 細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國實(shí)驗血液學(xué)雜志，2004，12(5):563-567.

［11］黃曉園，高慶蕾，莊 亮，等.Chk1/2 和Plk1 蛋白在宮頸癌良惡性病變組織中的表達(dá)及其意義［J］.中國癌癥雜志，2007，17(6):429-432.

［12］Tang J，Yang X，Liu X.Phosphorylation of Plk1 at Ser326 regulates its functions during mitotic progression［J］.Oncogene，2008，27(52):6635-6645.