武彥芳，路玉潔，鞠 境

（1.陜西省第四人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西安710043；2.南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 210029）

胃癌是目前全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，在2012年，全球有72.3萬(wàn)人由于罹患胃癌而死亡。我國(guó)作為胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率占全球發(fā)病的40%，居惡性腫瘤的第3位，僅次于肺癌和肝癌。目前胃癌的治療，多采用多種干預(yù)措施，如外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等，其中化學(xué)治療以治愈疾病或顯著延長(zhǎng)生命并改善患者生活質(zhì)量的效果而受到廣泛關(guān)注。但是化學(xué)治療藥物本身具有較大的毒副作用，易對(duì)患者產(chǎn)生較大生理、心理負(fù)擔(dān)［1］，因此尋找高效低毒的化學(xué)治療藥物對(duì)胃癌的治療具有重要意義。

藤茶（vine tea）又名“莓茶”，已鑒定出藤茶中含有19種人體必須的營(yíng)養(yǎng)成分和微量元素。從藤茶的莖葉中可提取的一種二氫黃酮醇類化合物命名為二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）［2］，它具有抗菌、抗氧化、保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂等多種生物活性，但其抗癌作用機(jī)制尚不明確。既往研究報(bào)道，DMY可聯(lián)合絲裂霉素抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［3］，但是從藤茶中直接提取的DMY對(duì)胃癌細(xì)胞的作用未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)超聲中性水浸提法提取藤茶中的活性成分DMY，經(jīng)過(guò)反相高效液相色譜（RP－HPLC）分離純化后的DMY的純度達(dá)到99%以上；以人胃癌細(xì)胞SGC7901為研究對(duì)象，使用CCK－8比色法檢測(cè)提取出來(lái)的DMY對(duì)胃癌細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DMY促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力，為將來(lái)進(jìn)一步研發(fā)DMY作為胃癌化學(xué)治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 人胃癌細(xì)胞SGC7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞SGC7901培養(yǎng)于RPMI1640（添加碳酸氫鈉1.5g/L，葡萄糖2.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L）。培養(yǎng)基含10%胎牛血清，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代。

1.1.2 試劑與儀器 野生藤茶購(gòu)自湖南張家界旺盛商貿(mào)有限公司；DMY標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都曼斯特生物科技公司（純度為98%），改良型RPMI1640（GIBCO公司，美國(guó)），胎牛血清（Hy－Clone公司，美國(guó)），CCK－8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），凋亡試劑盒（上海貝博生物）。ALPAAI－4LSC真空冷凍干燥機(jī)（Chris公司，德國(guó)），LC－20AD 高效液相色譜儀（HPLC，Shimadzu公司，日本），多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司，infinite M200）。

1.2 方法

1.2.1 提取與純化 將藤茶樣品放入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎混勻，采用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，其工藝參數(shù)為：超聲功率100W，超聲時(shí)間60min，液料比50∶1，提取溫度90℃。將提取液真空冷凍干燥進(jìn)行下一步純化，將提取物的粉末配成25mg/mL的上樣濃度，采用RP－HPLC分離純化方法，HPLC系統(tǒng)：Shimadzu LC－6AD；色譜柱：Chromstar AQC18 250mm×10mm，5μm；檢測(cè)器：SPD－M6A；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；進(jìn)樣量：5mL；洗脫液流速：5mL/min；洗脫條件如下：0～2min，0～15%甲醇；＞2～4min，＞15%～20%甲醇；＞4～10 min，＞20%～50%甲醇；＞10～30min，＞50%～80%甲醇；＞30～50min，＞80%～90%乙腈。將純化后的提取物真空冷凍干燥，檢測(cè)純度，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供原材料。采用優(yōu)化后的超聲中性水浸提法提取藤茶中的活性成分DMY，DMY的提取率達(dá)72%，由于粗提物的純度不能達(dá)到做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求，故在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)反向HPLC（RP－HPLC）進(jìn)一步分離純化。純化后DMY的純度達(dá)99%以上，可進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK－8比色法檢測(cè)細(xì)胞活率將密度為（4～5）×103/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞SGC7901接種在96孔板中，每孔90μL，于孵箱培養(yǎng)24h后，加入DMY（濃度分別為0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0mmoL）繼續(xù)培養(yǎng)。干燥后的DMY用DMSO溶解，同時(shí)用1.000 0mmoL DMSO處理作為對(duì)照組。處理后每孔體積100μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔分別加入10μL CCK－8試劑溶液，孵箱培養(yǎng)1h液體變黃后取出。用多功能酶標(biāo)儀在490nm處記錄吸光度（A490）。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝［處理組（A490）/對(duì)照組（A490）］×100%

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SGC7901，以2×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，加入DMY進(jìn)行處理，每組2個(gè)平行，加入DMSO作為對(duì)照組，48h后收集各組細(xì)胞和上清液，2 000r/min離心5min，棄上清液，加入PBS洗滌1次，以400μL 1×結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V－FITC染色液，混勻后避光15min，再加入10μL PI，2～8℃避光孵育5min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度DMY對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 不同濃度的DMY處理胃癌細(xì)胞72h后，CCK－8比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，DMY具有顯著的體外抗腫瘤作用，并且隨著處理濃度的增加，0.062 5mmoL及以上劑量實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異。見(jiàn)圖1。

圖1 DMY對(duì)細(xì)胞SGC7901的殺傷效應(yīng)

2.2 DMY促進(jìn)細(xì)胞SGC7901凋亡 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，可將細(xì)胞劃分為4個(gè)細(xì)胞亞群，分別為正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。不同濃度的DMY處理48h后，由于在顯微鏡下觀察到1.000 0mmoL DMY處理組的細(xì)胞呈懸浮碎片狀，無(wú)法完成細(xì)胞的收集，其余濃度處理的細(xì)胞，均可觀察到早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡細(xì)胞百分比顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2及表1。

圖2 DMY對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

表1 DMY對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）

表1 DMY對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

1.45±0.26 1.22±0.15 2.67±0.41 0.34±0.04 DMY處理組（mmol）0.062 5 3.36±0.46a 2.53±0.15a 4.95±0.2a 0.73±0.05 0.125 0 5.53±0.38a 3.75±0.13a 8.99±0.84a 1.23±0.11 0.250 0 7.72±0.25a 5.43±0.42a 12.59±0.39a 1.71±0.16 0.500 0 32.96±0.5a 13.01±0.48a 43.90±1.19a 1.95±0.12組別 早期凋亡細(xì)胞 晚期凋亡細(xì)胞 總凋亡細(xì)胞 壞死細(xì)胞對(duì)照組a

3 討 論

細(xì)胞凋亡又叫做“程序性細(xì)胞死亡”，是細(xì)胞的一種生理性、主動(dòng)性的“自覺(jué)自殺行為”，而非病理性死亡；并且凋亡作為機(jī)體清除損傷細(xì)胞的一種機(jī)制，有效保持機(jī)體自身發(fā)育、組織和器官的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。既往研究表明，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂有密切關(guān)系［4］。細(xì)胞凋亡參與了癌癥的起始過(guò)程，并對(duì)癌癥的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用。癌前期細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡更為敏感，更易被清除，這是機(jī)體自我保護(hù)功能的表現(xiàn)［5］。實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞凋亡與肝癌生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。肝癌細(xì)胞組織培養(yǎng)顯示，廣泛輕微損傷或刺激可誘導(dǎo)試管內(nèi)肝癌細(xì)胞的凋亡。Kelner等［6］指出，TGFβ－1可促進(jìn)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中DNA降解，并可通過(guò)受體連接使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的目的。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，植物提取化合物通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用已經(jīng)成為癌癥治療研究的一個(gè)新熱點(diǎn)［7］。體外實(shí)驗(yàn)證明，DMY對(duì)多種癌細(xì)胞如白血病、肝癌、乳腺癌和黑色素瘤等 有 明 顯 的 增 殖 抑 制 作 用［8－12］。Lin 等［13］報(bào) 道，DMY可通過(guò)激活 Cyt c、caspase－9and PARP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。線粒體釋放 Cyt c從而活化了caspase－9，而 PARP作為caspase－9的底物，在DNA損傷的修復(fù)、細(xì)胞死亡中起重要作用，它的活化是DNA損傷早期應(yīng)答的指標(biāo)。此外，有研究報(bào)道，DMY可顯著上調(diào)P53的表達(dá)，在P53的介導(dǎo)下下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。但是，關(guān)于DMY誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究顯示，白藜蘆醇可以通過(guò)對(duì)Survivin蛋白表達(dá)的調(diào)控從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的［15］。因此，推測(cè)與白藜蘆醇均有相似生物活性的DMY可能也有類似的抗癌作用機(jī)制。

本研究首先使用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，并將其純化并且進(jìn)行真空干燥使其可直接參與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。以胃癌SGC7901細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度的DMY進(jìn)行處理，觀察DMY對(duì)SGC7901細(xì)胞的存活率的影響，結(jié)果表明0.062 5～1.000 0mmol的 DMY均能不同程度地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并呈明顯的濃度－效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DMY處理過(guò)的細(xì)胞SGC7901，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡細(xì)胞百分比都成明顯上升趨勢(shì)。由于腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)，細(xì)胞凋亡程序被擾亂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中這一機(jī)制失去作用，所以它能夠肆意增殖［16］。促使腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)作為一種治療癌癥的主要措施之一［17］。大量對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究提供了一個(gè)令人信服的解釋，即腫瘤并非死于DNA損傷而是重新誘發(fā)了凋亡程序，DNA損傷在凋亡誘導(dǎo)中也許十分重要，但是不可能直接殺死細(xì)胞，因此凋亡可能是誘導(dǎo)腫瘤死亡的機(jī)制［18］。既往研究表明，DMY能有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞 MDA－MB－231、肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，有助于細(xì)胞凋亡程序的修復(fù)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞增殖和凋亡間的平衡對(duì)抑制腫瘤的持續(xù)發(fā)展可能具有重要意義。因此，本研究結(jié)果提示DMY促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是其防治胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以人胃癌細(xì)胞SGC7901為研究對(duì)象，利用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，并觀察DMY對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMY能夠呈濃度依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究明確了DMY促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用，為進(jìn)一步研究DMY抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

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