李 偉，羅 霞，馬小倩*

(1．中南大學湘雅三醫(yī)院細胞移植與基因治療中心，湖南 長沙410013;2．湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，湖南 長沙410013)

結直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分居惡性腫瘤的第六位和第五位，發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢［1］。結直腸癌的發(fā)病與人的生活方式、飲食結構及遺傳背景密切相關。早期結直腸癌以外科手術治療為主，然而由于結直腸癌早期發(fā)病隱匿，近1/3的患者在初診時已是晚期，失去了根治性手術治療的機會。雖然目前研究證實APC，EGFR和k－ras等基因的突變直接參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［2］，而且針對EGFR等蛋白的靶向性藥物如西妥昔單抗也已成功用于臨床［3］，但由于結直腸癌患者本身對靶向性藥物的不敏感，或者是對靶向藥物和化療藥物的繼發(fā)耐藥，晚期結直腸癌患者的預后并不樂觀［4］。深入研究結直腸癌發(fā)病的分子機制，尋找新的藥物作用靶點和開發(fā)新的預防與治療手段已成為亟待解決的醫(yī)學難題。

TRAF4(Tumor necrosis factor receptor associated factor 4)因在人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結組織中基因擴增和蛋白高表達而被首次發(fā)現(xiàn)［5］。與其他TRAF家族成員不同的是，TRAF4最重要的生理功能似乎并不是調(diào)控體內(nèi)的免疫及炎癥反應，而是參與調(diào)節(jié)胚胎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［6］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4在多種腫瘤細胞及腫瘤組織中存在異常的高表達，包括乳腺癌、肺癌和結直腸癌等［7］，但TRAF4高表達的分子機制及其介導的生物學功能還不清楚，關于TRAF4與結直腸癌發(fā)病的相關研究還少有文獻報道。TRAF4高表達是否促進了結直腸癌的惡性表型?本研究將以結直腸癌為研究模型，以糖代謝為切入點，從細胞增殖及凋亡等角度研究TRAF4對結直腸癌細胞惡性表現(xiàn)及糖代謝的調(diào)控。

1 材料與方法

1．1 細胞系

人結直腸癌細胞系HCT116和SW620細胞購自美國ATCC。細胞用含有10%FBS和1%雙抗生素的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培基常規(guī)培養(yǎng)，每1－2天換液，細胞融合度達到80%時傳代。

1．2 主要試劑/試劑盒和主要抗體和儀器

常用化學試劑均購自Sigma公司。DMEM培基，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)和雙抗生素(青霉素 和 鏈 霉 素，P＆S)購 自invitrogen公 司;p－Akt－Ser473(#4060)，HK2(#2867)，VDAC(#4661)，cleaved－caspase3(#9664)和cleaved－PARP(#5625)抗體購自Cell Signaling Technology公司;TRAF4(sc－10776)，α－tubulin(sc－8035)和β－actin(sc－47778)抗體購自Santa Cruz公司。CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit購自promega，BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce，Polybrene和puromycin購 自 Millipore 公 司。pLKO．1－shTRAF4 (#1，TRCN0000034242;#2，TRCN0000034243)質(zhì)粒購自Thermo(open biosystem)。

1．3 主要方法

1．3．1 慢病毒感染介導的基因沉默

A．慢病毒的包裝及收集:取對數(shù)生長期293T細胞，按照2×106/皿接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中。次日，將含有TRAF4 shRNA序列的慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒PSPAX2和PMD2G按照質(zhì)量比4∶3∶1(總質(zhì)量8μg)的比例共轉(zhuǎn)染293T細胞。次日，棄培基，更換新的DMEM完全培基。48 h后，收集細胞培養(yǎng)液上清(含病毒)，4 000 r/min離心5 min去除細胞殘渣，并經(jīng)0．45μmol/L濾器過濾，上清中即含有包裝成功的慢病毒顆粒。

B．慢病毒感染:將適量處于對數(shù)生長期的細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。次日，取7 mL新鮮培基與3 mL病毒懸液，加入終濃度為10μg/mL的polybrane，混勻后加入待感染的細胞中，5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24小時。第三天，棄培基，加入含有1μg/mL puromycin的新鮮培基，進行穩(wěn)定細胞系的篩選培養(yǎng)。待puromycin將對照組細胞(未感染病毒組)全部殺死(通常為2～3天全部死亡)，而存活的病毒感染組細胞即為基因沉默的穩(wěn)定細胞系。收集細胞裂解液，western blot鑒定細胞系及基因沉默效率。

1．3．2 停泊非依賴生長(軟瓊脂集落形成)實驗

A．準備1．25%瓊脂凝膠和2×BME并46℃保溫備用。

B．準備下層瓊脂凝膠(180 mL體系):其中含有2×BME(70 mL)，L－Glutamine(2 mL)，Gentamicin(100μL)，1×PBS(18 mL)，F(xiàn)BS(18 mL)。預熱后加入1．25%agar(72 mL)。

將準備好的下層瓊脂凝膠迅速加入六孔板中，每孔3 mL，超凈臺中靜置1 h，使其充分凝固。

C．制備細胞懸液。取對數(shù)生長期細胞，消化后計數(shù)，用含10%FBS的1×BME稀釋成24 000/mL細胞懸液備用。

D．制備含有細胞懸液的上層凝膠。取下層凝膠2．4 mL(含不同濃度的辣椒素)，加入1．2 mL細胞懸液，輕輕吹打混勻，迅速加入含有下層凝膠的六孔板中，每孔1 mL。

待上層瓊脂凝固后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜置1－3周。用顯微鏡進行克隆統(tǒng)計。

1．3．3 細胞線粒體抽提及蛋白質(zhì)濃度測定和Western blotting分析

將細胞(不少于1×107)消化后，800 r/min離心5 min，棄上清，1×PBS洗1次，棄PBS，加入線粒體抽提液(MSHE+BSA:70 mmol/L sucrose，210 mmol/L mannitol，5．0 mmol/L HEPES，1．0 mmmol/L EGTA，0．5%(W/V)fatty acid free－BSA和蛋白酶Cocktail抑制劑，調(diào)PH值至7．2)1 mL，冰上放置3 min后，將上述溶液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，冰上勻漿40－60次。轉(zhuǎn)移研磨后的懸液至EP管中，漩渦震蕩15 s，2 000 r/min，4℃離心10 min。轉(zhuǎn)移上清至新的EP管，13 000 r/min，4℃離心30 min。棄上清，向沉淀中加入0．2 mL線粒體抽提液，漩渦震蕩15 s，將沉淀重懸，13 000 r/min，4℃離心10 min。棄上清，所得沉淀即為線粒體。向沉淀中加入0．1 mL含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA(25 mmol/Ltris·HCl PH7．6，150 mmol/L NaCl，1% NP－40，1% sodium deoxycholate，0．1%SDS)裂解液，冰上放置30 min，適當超聲破碎，13 000 r/min，4℃離心15 min。上清即為線粒體蛋白。蛋白濃度用BCA蛋白定量試劑盒測定。取30μg蛋白在變性不連續(xù)SDS－PAGE電泳中分離并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。含蛋白的硝酸纖維膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，再與特異性單克隆抗體4℃孵育過夜，1×PBST洗滌三次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h，1×PBST洗滌三次，每次10 min，加入ECL化學發(fā)光底物，X光片曝光、顯影、定影。

1．3．4 細胞葡萄糖攝取及乳酸生成速率測定

取5×105個處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后(4 h左右)，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后收集細胞培養(yǎng)上清。在湘雅醫(yī)院檢驗科生化實驗室用全自動臨床生化檢測儀(Automatic biochemical analyzer，7170A，HITACHI，Japan)檢測培養(yǎng)上清中葡萄糖及乳酸含量。全自動臨床生化檢測儀在每次使用時均用標準品進行校正。

1．3．5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計不同時間、不同組別間的比較采用多因素的方差分析，實驗組與對照組間的比較采用t檢驗。*代表P＜0．05，說明兩組之間具有顯著性差異。

2 實驗結果

2．1 基因沉默TRAF4抑制結直腸癌細胞生長

首先，我們采用MTS的實驗方法檢測基因沉默TRAF4對結直腸癌細胞系停泊依賴增殖的影響。結果如圖1所示，TRAF4表達抑制后，明顯抑制了SW620(圖1，左)和HCT116(圖1，右)細胞的增殖。

進一步，利用克隆形成實驗，我們檢測了基因沉默TRAF4對結直腸癌細胞系軟瓊脂集落形成能力這一惡性表型的影響。結果顯示，下調(diào)TRAF4明顯抑制了SW620(圖2，左)和HCT116(圖2，右)的停泊非依賴生長。

2．2 基因沉默TRAF4抑制EGF誘導的Akt活化

結直腸癌細胞的快速增殖常Akt信號通路的異常激活有關，基因沉默TRAF4抑制了結直腸癌細胞的停泊依賴和非依賴生長，這是否與Akt的活性改變有關?我們檢測了HCT116細胞，基因沉默TRAF4后對EGF(50μg/mL)誘導的Akt活化的影響，結果顯示，TRAF4表達下調(diào)抑制了EGF誘導的Akt磷酸化活化(圖3，左)，但不影響IGF1(50μg/mL)誘導的Akt磷酸化活化(圖3，右)。

2．3 基因沉默TRAF4下調(diào)結直腸癌細胞糖酵解

Akt磷酸化活化對腫瘤細胞糖代謝至關重要。我們發(fā)現(xiàn)，基因沉默TRAF4在下調(diào)Akt磷酸化的同時明顯抑制了結直腸癌細胞SW620(圖4，上)和HCT116(圖4，下)己糖激酶的表達(圖4，左上;圖4，左下)。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，己糖激酶表達的下調(diào)伴隨著細胞有氧糖酵解的抑制?；虺聊琓RAF4明顯抑制了結直腸癌細胞葡萄糖的攝取速率(圖4，上中;圖4，上中)和乳酸的生成效率(圖4，右上;圖5，右下)。

2．4 基因沉默TRAF4下調(diào)HK2的線粒體表達并上調(diào)結直腸癌細胞對5－Fu的敏感性

己糖激酶HK2定位于線粒體外膜不僅可以增加細胞糖酵解的效率，而且可以促進腫瘤細胞對化療藥物的耐受增強其抗凋亡能力。抽提線粒體蛋白，我們研究發(fā)現(xiàn)，基因沉默TRAF4明顯抑制了HK2在線粒體的表達水平(圖5，左)。而且，我們給予HCT116細胞5μmol/L 5－Fu處理24 h，TRAF4基因沉默組出現(xiàn)細胞死亡，免疫印跡檢測可發(fā)現(xiàn)caspase3和PARP出現(xiàn)明顯的剪切體(圖5，右)。

圖1 基因沉默TRAF4抑制SW620(左)和HCT116(右)細胞停泊依賴生長(P＜0．05)Fig．1 Knockdown TRAF4 attenuates SW620(left)and HCT116(right)cells anchorage－dependent growth(P＜0．05)

圖2 基因沉默TRAF4抑制SW620(上)和HCT116(下)細胞停泊非依賴生長生長(P＜0．05)Fig．2 Knockdown TRAF4 attenuates SW620(top)and HCT116(bottom)cells anchorage－independent growth(P＜0．05)

圖3 基因沉默TRAF4下調(diào)EGF誘導的Akt活化(左)，但不影響IGF1誘導的Akt活化(右)Fig．3 Knockdown TRAF4 decreases EGF－induced Akt activation(left)，but have no obvious effect on IGF1－induced Akt phosphorylation(right)

圖4 基因沉默TRAF4抑制結直腸癌細胞SW620(上)和HCT116(下)糖代謝(P＜0．05)Fig．4 Knockdown TRAF4 inhibits glycolysis in SW620(top)and HCT116(bottom)colon cancer cells(P＜0．05)

3 討論

越來越多的研究表明，TRAF4過表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。在已有的多種上皮來源的惡性腫瘤，淋巴瘤及其他類型腫瘤如惡性胸膜間皮瘤中都已檢測到TRAF4的過表達。雖然在免疫系統(tǒng)相關疾病研究中證實TRAF4參與調(diào)控多條信號通路的活化，如TRAF4通過與NOD2相互作用而抑制先天性免疫反應［8］，TRAF4介導了GITR誘導的NF－κB激活［9］，但TRAF4在多種腫瘤中高表達的生物學功能還不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，TRAF4通過上調(diào)TGF－β受體信號通路，誘導乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［10］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4與結直腸癌細胞的快速增殖及克隆形成能力等惡性表型密切相關?；虺聊琓RAF4表達不僅可明顯抑制SW620和HCT116細胞的增殖(圖1)，而且顯著下調(diào)這兩種腫瘤細胞的軟瓊脂克隆形成能力(圖2)。研究表明，在結直腸癌中，由于EGFR或k－ras基因突變導致的下游信號異?；罨墙Y直腸癌細胞快速增殖的主要原因之一。而且，文獻報道業(yè)已證實，在肺癌中，TRAF4過表達直接參與了Akt磷酸化活化［11］。我們研究發(fā)現(xiàn)在結直腸癌細胞HCT116中，基因沉默TRAF4同樣能明顯抑制EGF誘導的Akt磷酸化活化(圖3)，這提示在結直腸癌中，Akt的活化與該類腫瘤的快速增殖密切相關。

為了維持持續(xù)快速的增殖，多種腫瘤細胞即使在有氧情況下仍然采用糖酵解的方式來快速產(chǎn)生ATP作為其主要的供能方式，這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應［12］。有氧糖酵解不僅為腫瘤細胞提供有效的能量供給，其產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物也為腫瘤細胞快速增殖過程中的生物合成提供足夠的中間分子。以腫瘤細胞異常活化的糖酵解為原理開發(fā)的PET－CT技術已成為目前腫瘤影像診斷的重要手段之一。我們發(fā)現(xiàn)，在HCT116和SW620細胞內(nèi)基因沉默TRAF4抑制了這兩種腫瘤細胞的糖酵解，其葡萄糖攝取和乳酸生成能力顯著下調(diào)(圖4)。作為糖酵解的第一個限速酶，HK2在多種腫瘤中異常高表達。而且，多種腫瘤中HK2的表達上調(diào)受到Akt激酶的調(diào)控［13］。我們前期研究已證實在結直腸癌中，TRAF4直接參與了Akt的磷酸化活化。在TRAF4基因沉默的HCT116和SW620細胞內(nèi)，糖酵解下調(diào)是否與Akt的活化抑制和HK2的表達下調(diào)有關?結果表明，基因沉默TRAF4在抑制Akt活化的同時，確實導致了HK2的總蛋白表達水平下調(diào)(圖4)。

作為線粒體膜組成型表達蛋白，HK2的線粒體外膜定位不僅可以提高細胞對葡萄糖的攝取效率，而且，HK2可以通過與VDAC形成復合物，共同維持線粒體的電勢平衡，促進細胞的凋亡抵抗，這一結構特征也是多種腫瘤細胞內(nèi)HK2過表達導致腫瘤細胞放化療抵抗的機制之一［14－17］。通過抽提線粒體蛋白，我們進一步證實了在TRAF4基因沉默的HCT116細胞內(nèi)，HK2的線粒體表達水平被下調(diào)(圖5)，這一結果提示，TRAF4表達抑制后，或許能提高結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性。因此，我們采用結直腸癌最常見的化療藥物5－Fu處理細胞，并通過western blot檢測TRAF4表達抑制后結直腸癌細胞內(nèi)凋亡相關分子的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)，5μmol/L 5－Fu在處理TRAF4基因沉默的HCT116 24 h后，即能明顯促進caspase3和PARP剪切體的形成，誘導細胞發(fā)生凋亡。我們的研究從TRAF4調(diào)控Akt活化影響HK2的表達及糖酵解的角度初步證明了TRAF4對結直腸癌快速增殖這一惡性表型的影響，當然，在結直腸癌中，TRAF4是否參與了其他信號通路的調(diào)控而促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展還有待進一步研究。本研究為靶向TRAF4或結直腸癌細胞糖酵解的新的治療手段的開發(fā)提供了一種潛在的可能。

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