郭永霞，王麗艷，孫 強，荊瑞勇，殷奎德

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶163319)

亞麻(Linum usitatissimumL．)為雙子葉植物，是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(Linum)的一年生草本植物，是我國重要的經(jīng)濟作物，油用亞麻是一種重要的油料作物，纖用亞麻是重要天然纖維的來源。我國的亞麻產(chǎn)量和質(zhì)量水平與發(fā)達國家相比有很大的差距，其原因是多方面的，而主要原因之一還是亞麻品種相對比較落后。干旱、鹽堿、低溫等是限制作物生產(chǎn)的主要外界環(huán)境條件。目前隨著經(jīng)濟發(fā)展，人口急劇增加，以及全球氣候的變化，這些環(huán)境問題在持續(xù)加重。其中干旱對作物產(chǎn)量的影響，在各種自然逆境中占據(jù)首位，其危害僅次于生物脅迫病蟲害造成的損失，相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。NDPK2基因編碼植物核苷二磷酸激酶2(NDPK2)，Moon H等人發(fā)現(xiàn)NDPK2可參與促分裂原蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合MAPK6和MAPK3［1］，進而上調(diào)POD、硫氧還蛋白、CAT、過氧化物還原酶和硫氧還蛋白還原酶等多種抗氧化酶基因的表達，從而調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)［2］。擬南芥核苷二磷酸激酶2基因(At－NDPK2)通過對馬鈴薯［3］、大麥［4］、苜蓿［5］的遺傳轉(zhuǎn)化研究也表明:AtNDPK2基因的過量表達可增強作物對干旱、鹽漬或極端溫度的忍耐性。迄今為止，未見有關(guān)AtNDPK2基因在亞麻中遺傳轉(zhuǎn)化的報道。本研究旨在以雙亞7號下胚軸為外植體，通過對遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化來建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。具體是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將脅迫誘導(dǎo)型啟動子SWPA2與AtNDPK2基因構(gòu)建共表達載體導(dǎo)入雙亞7號，以期獲得耐性更強的轉(zhuǎn)基因亞麻，為亞麻抗逆品種的培育奠定基礎(chǔ)，同時也為亞麻基因工程操作技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試亞麻品種雙亞7號由黑龍江省科學(xué)院亞麻研究所夏尊民研究員惠贈。培養(yǎng)5 d的亞麻下胚軸外植體做為轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化和基因轉(zhuǎn)化的材料。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105和質(zhì)粒pCAMBIA2300由韓國生命工學(xué)研究院環(huán)境生命工學(xué)研究中心的郭尚珠教授惠贈。

含有目的基因AtNDPK2的重組質(zhì)粒載體也由郭尚珠教授惠贈，包含脅迫誘導(dǎo)型啟動子SWPA2，并攜帶目的基因AtNDPK2，npt－Ⅱ為篩選標記基因。

1．2 試驗方法

1．2．1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和篩選濃度的確定 選取雙亞7號5 d的無菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計下胚軸的分化增殖情況。Kan和G418濃度均設(shè)置為0，50，100，150，200 mg·L-1，每個處理接種10個下胚軸，5次重復(fù)，總計接種50個下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。

1．2．2 最佳預(yù)培養(yǎng)時間的確定 選取雙亞7號培養(yǎng)5 d的無菌苗下胚軸，轉(zhuǎn)化前在分化增殖培養(yǎng)基上設(shè)置0、1、2、3、4、5 d時間進行預(yù)培養(yǎng)，經(jīng)相同的農(nóng)桿菌處理濃度、相同共培養(yǎng)時間和相同篩選條件，每個處理接種10個下胚軸，5次重復(fù)，總計接種50個下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。培養(yǎng)30 d后，通過統(tǒng)計分析，比較不同處理的抗性再生率，以確定最適的預(yù)培養(yǎng)時間。

1．2．3 最佳共培養(yǎng)時間的確定 以雙亞7號為材料，切取下胚軸并侵染后，置于共培養(yǎng)基上，分別共培養(yǎng)0，1，2，3，4，5 d，然后轉(zhuǎn)入含有一定濃度篩選抗生素的培養(yǎng)基上，每個處理接種10個下胚軸，5次重復(fù)，總計接種50個下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計抗性芽誘導(dǎo)率。

1．2．4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化及植株再生 將雙亞7號和晉亞7號培養(yǎng)5 d苗齡的無菌苗下胚軸在切成0．5 cm左右，搖動10-15 min。然后用滅過菌的濾紙吸干下胚軸表面的農(nóng)桿菌，置于不含抗生素的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，共培養(yǎng)結(jié)束后將下胚軸轉(zhuǎn)入含50 mg·L-1G418和250 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養(yǎng)基中，在(25±2)℃，14 h/10 h光周期條件下培養(yǎng)45 d，每15 d繼代一次。當(dāng)分化出抗性小芽后，將抗性小芽轉(zhuǎn)接到加有篩選抗生素G418的加有Cef的分化增殖培養(yǎng)基中進行分化增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)一定量的抗性小芽后，將抗性小芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待小苗長至3-4 cm左右時，從基部切成單株，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基中同樣加有G418。

1．2．5 再生植株的PCR檢測 用目的基因特異性引物進行目的基因的PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1．2%的瓊脂糖凝膠上電泳25-30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)AtNDPK2基因序列設(shè)計特異性引物，引物1:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3';引物2:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，擴增的目的片段大小為540 bp，擴增時以未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA作為陰性對照，質(zhì)粒DNA作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2．1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和篩選濃度的確定

選取雙亞7號培養(yǎng)5 d的無菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計下胚軸的分化增殖情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和濃度對增殖系數(shù)的影響Fig．1 Effect of type and concentration of antibiotic in selective media on proliferation coefficient

由圖中可以看出，兩種抗生素對亞麻下胚軸分化增殖的影響差異很大，其中G418濃度為50 mg·L-1時，培養(yǎng)30 d后，下胚軸已經(jīng)枯死;而對Kan來說，隨著濃度的增加，增殖系數(shù)略有下降，但從方差分析來看，從0、50、100、150 mg·L-1之間，增殖系數(shù)沒有顯著性差異，0、50、100 mg·L-1與200 mg·L-1之間有顯著性差異，150與200 mg·L-1之間無顯著性差異。當(dāng)Kan濃度增加到200 mg·L-1時，增殖系數(shù)仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素，選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1。

2．2 不同預(yù)培養(yǎng)時間對亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化前的預(yù)培養(yǎng)對于植物遺傳轉(zhuǎn)化具有重要意義，本試驗對亞麻下胚軸分別進行了0、1、2、3、4、5 d的預(yù)培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)生抗性芽的個數(shù)/接種的下胚軸總數(shù))結(jié)果如圖2。

從圖中可以看出，預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率有一定的影響，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中培養(yǎng)2 d時下胚軸轉(zhuǎn)化率最高為7%，其次是培養(yǎng)3d時的轉(zhuǎn)化效率為6%，但從方差分析可以看出，培養(yǎng)2 d和培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)化率沒有顯著性差異，但與其它的培養(yǎng)時間0，1，4，5 d均存在顯著性差異。因此本試驗選擇預(yù)培養(yǎng)2 d進行轉(zhuǎn)化試驗。

圖2 不同的預(yù)培養(yǎng)時間對亞麻下胚軸轉(zhuǎn)化率的影響Fig．2 Effect of different pretreatment time on conversion percent of flax hypocotyl

2．3 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)在整個轉(zhuǎn)化過程中是非常重要的環(huán)節(jié)，因為農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合都在這個時期內(nèi)完成，因此確定共培養(yǎng)條件是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。最佳共培養(yǎng)時間的確定，一方面使農(nóng)桿菌附著外植體表面后在創(chuàng)傷部位生存一定時間后能夠誘發(fā)腫瘤，因此共培養(yǎng)時間不能太短，但也不宜太長，否則，可能會由于農(nóng)桿菌的過度生長而使植物細胞受到毒害而死亡，不死亡也會在后續(xù)培養(yǎng)中難以抑制。因此確定一個適宜的共培養(yǎng)時間是一個好的轉(zhuǎn)化體系所必須的。試驗結(jié)果圖3所示。

圖3 共培養(yǎng)時間對亞麻下胚軸轉(zhuǎn)化率的影響Fig．3 Effect of co-culture time on conversion percent of flax hypocotyl

從圖中可以看出，外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率有較大的影響，隨著共培養(yǎng)時間的增加轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當(dāng)共培養(yǎng)3 d時，轉(zhuǎn)化率最高達20．45%，不進行共培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化的率為0，原因是因為農(nóng)桿菌附著在外植體表面并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存8-16 h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤。超過3 d后轉(zhuǎn)化率下降，是因為共培養(yǎng)后在篩選培養(yǎng)基中有的外植體死亡，有的長出農(nóng)桿菌，因此導(dǎo)致總的轉(zhuǎn)化率降低。從方差分析可以看出，共培養(yǎng)3 d與其它共培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)化率之間存在顯著性差異，因此選擇3d做為共培養(yǎng)的最佳時間。

2．4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化及植株再生

將雙亞7號培養(yǎng)5 d苗齡的亞麻，下胚軸切成0．5 cm左右，放在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，取出放于OD0．6-0．8的農(nóng)桿菌菌液中搖動10-15 min。然后用滅過菌的濾紙吸干下胚軸表面的農(nóng)桿菌，置于不含抗生素的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，共培養(yǎng)結(jié)束后將下胚軸轉(zhuǎn)入含50 mg·L-1G418和300 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)30 d左右，下胚軸大部分形成的愈傷組織及分化的小芽死亡，只有少數(shù)的小芽能夠繼續(xù)存活(圖4A)，存活率能達到23．5%。將抗性小芽轉(zhuǎn)接到芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抗性小芽長高(圖4B)，將其分成單株接種到加有50 mg·L-1的G418生根培養(yǎng)基中，10 d左右能長出大約15條/株的根，形成抗性植株(圖4C)。

圖4 G418抗性植株的生長過程Fig．4 Growth process of Resistance plant G418

2．5 亞麻抗性植株的PCR檢測

對獲得的抗性植株，經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)及伸長生長培養(yǎng)后，對獲得的6個株系的組培苗進行了轉(zhuǎn)基因檢測。使用無菌苗的葉片提取基因組DNA，用AtNDPK2的特異性引物進行PCR檢測，來擴增目的基因特異性片段。結(jié)果有4個株系擴增出了目的條帶，陽性率為66．67%。檢測的圖片見圖5。

圖5 亞麻轉(zhuǎn)AtNDPK2基因抗性植株P(guān)CR電泳圖Fig．5 PCR profile of transgenetic resistance plant withAtNDPK2

從圖2可知，陰性對照無擴增條帶，lane 1～6是抗性植株的擴增情況，其中1，4，5，6與陽性質(zhì)粒DNA擴增出的帶與AtNDPK2基因大小相符，實驗結(jié)果表明，1，4，5，6株系A(chǔ)tNDPK2基因已轉(zhuǎn)入亞麻基因組中。而2，3株系未擴增出目的條帶，AtNDPK2基因未轉(zhuǎn)化成功。

3 討論

本研究中植物表達載體上攜帶有目前植物基因工程中使用最廣泛的篩選基因nptⅡ基因，nptⅡ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，若該基因整合進亞麻基因組中，它能使Kan(卡那霉素)、geneticin(G418)、Neo(新霉素)等氨基糖苷類抗生素磷酸化，使轉(zhuǎn)化細胞以及再生植株具有抗這三種抗生素的能力［6］。Jin-Zhuo Dong等對亞麻的兩種篩選抗生素進行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞麻下胚軸對Kan和G418顯示出兩種不同的反應(yīng)，Kan是一個比G418溫和的篩選劑［7］。這一結(jié)果在桃的遺傳轉(zhuǎn)化中也有類似的報告［8］。但國內(nèi)研究者的報道與以上結(jié)果有所不同，李學(xué)寶等人在對亞麻下胚軸進行轉(zhuǎn)化研究時發(fā)現(xiàn)在含Kan50 mg·L-1的選擇培養(yǎng)基上篩選獲得Kan抗性苗，并檢測到GUS基因活性表達［9］。王玉富等在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行亞麻轉(zhuǎn)基因研究時，在篩選培養(yǎng)基中加入了50 mg·L-1的Kan和1 000 mg·L-1的頭孢霉素［10］。本試驗中對兩種篩選抗生素Kan和G418也進行了比較研究，當(dāng)Kan濃度增加到200 mg·L-1時，亞麻的增殖系數(shù)仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素。G418濃度為50 mg·L-1時，培養(yǎng)30d后，下胚軸已經(jīng)枯死，因此選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1，此結(jié)果與前人報道在濃度上有所差異，這應(yīng)該與不同的亞麻基因型、外植體，甚至不同的試劑有關(guān)。

一般認為預(yù)培養(yǎng)對外植體的轉(zhuǎn)化是有利的，它可以促進外植體細胞分裂，分裂狀態(tài)的細胞會更容易整合外源DNA，從而提高外源基因的轉(zhuǎn)化率［11］。姬妍茹等的研究發(fā)現(xiàn)，是否進行預(yù)培養(yǎng)直接影響著受體的一周成活率，外植體子葉和下胚軸的GUS瞬時表達率在預(yù)培養(yǎng)2 d后開始出現(xiàn)下降趨勢，雖然不進行預(yù)培養(yǎng)有100%的GUS瞬時表達，但外植體生長狀態(tài)不佳，成活率低，難于進行再分化［12］。Bretagne-Sagnard等人在GUS染色試驗的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)和剝皮同樣能夠使瞬時轉(zhuǎn)化率提高［13］。Dong等人在試驗研究中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的下胚軸切口兩端有較強的染色效果，預(yù)培養(yǎng)時間超過6天的染色強度反而降低［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化率是有影響的，預(yù)培養(yǎng)2-3d為最佳時間，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谶@一時間時，轉(zhuǎn)化率都會有所下降，這與前人的研究結(jié)果稍有差異。

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