孫海波+鄒美智+任洪巖+王景余+李艷萍+馮瑞光

摘 ? ?要：利用分子標記輔助選擇技術(shù)對62份水稻種質(zhì)資源進行篩選攜帶Xa23、Stvb-i、Pi-1抗病基因種質(zhì)資源。結(jié)果表明：經(jīng)PCR檢測，從中選擇出含兩種抗病基因的材料有10個，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽性的材料有4個，Xa23和Stvb-i呈陽性的材料有1個，Pi-1和Stvb-i呈陽性的材料有5個;含有一種抗病基因材料40個，占64.5%，其中Xa23呈陽性的材料有3個，占4.8%;Pi-1呈陽性的材料有17個，占27.4%;Stvb-i呈陽性的材料有20個，占32.3%;本試驗為實現(xiàn)分子標記輔助選擇水稻抗病育種打下了堅實的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻種質(zhì)資源;分子標記輔助選擇;抗病;Xa23;Stvb-i;Pi-1

中圖分類號：S511 ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.04.001

Screening the Rice Germplasm Containing Disease-resistant Genes Xa23， Stvb-I， Pi-1 by Molecular Marker-assisted Method

SUN Hai-bo，ZOU Mei-zhi，REN Hong-yan，WANG Jing-yu，LI Yan-ping，F(xiàn)ENG Rui-guang

（Tianjin Crops Research Institute， Tianjin 300384，China）

Abstract：In the study， the rice germplasm containing disease-resistant genes Xa23， Stvb-i， Pi-1 was screened from 62 anther culture descendants by molecular marker-assisted method. The results showed that 10 rice cultivars having two disease resistant genes was obtained， which was 16.1%. Among them， 4 cultivars contained Xa23 and Pi-1， one cultivar had Xa23 and Stvb-I， and 5 cultivars contained Pi-1 and Stvb-i. There are 40 cultivars carrying one disease resistant gene， which was 64.5%. In which 3 cultivars carried Xa23 （4.8%）， 17 ones carried Pi-1 （27.4%） and 20 ones had Stvb-i （32.3%）. Such findings in the paper provided basis for breeding of disease-resistant rice by molecular marker-assisted method.

Key words： rice germplasm;marker-assisted selection;resistance;Xa23;Stvb-i;Pi-1

病害是水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因子。在水稻生產(chǎn)中，白葉枯病、稻瘟病和條紋葉枯病，廣泛發(fā)生在全國各個稻區(qū)，流行年份一般減產(chǎn)10%～20%，重者高達40%～50%，甚至絕收 [1]。實踐證明，選育和應用水稻抗病品種，利用其自身的抗病性是目前防治水稻病害的最經(jīng)濟、最有效的措施[2]。因此，為了高效地培育出抗病品種，開展水稻抗病基因型分子標記輔助選擇，充分利用抗病基因的表達來防止和控制這三大病害的發(fā)生，具有實際意義。

分子標記輔助選擇是直接通過與目的基因緊密連鎖的分子標記來選擇基因型[3]，因其不易受環(huán)境影響，選擇結(jié)果科學可靠，并可以在早代進行選擇，故被廣泛地用于水稻白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病等抗病育種中，已成為水稻抗病育種的一個重要輔助手段。Xa23是一個來自普通野生稻的抗白葉枯病、抗譜最廣、全生育期抗性導入效應強的完全顯性基因[4]，已報道常用的Xa23標記主要有RM206[5]、C189[6]等。Pi-1是一個來源于秈稻品種AC23中的具廣譜抗性的顯性抗稻瘟病基因[7]，已報道常用的Pi-1標記主要有MRG4766[8]、RM144[9]等;Stvb-i是一個顯性的全生育期高抗條紋葉枯病基因[10]，已報道常用的Stvb-i標記主要有ST10[11]、RM11-8[12]等。

本研究試圖利用分子標記技術(shù)輔助選擇攜帶抗Xa23、Stvb-i、Pi-1三種病害基因的種質(zhì)資源，以期掌握水稻種質(zhì)資源是否含有抗病基因，為分子設(shè)計水稻抗病育種提供科學依據(jù)。

1 ? ?材料和方法

1.1 ? ?試驗材料

陽性植株對照親本分別為攜帶抗白葉枯病Xa23基因的水稻材料BG152、攜帶抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118（由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供）和攜帶抗條紋葉枯病Stvb-i基因的花育409，以及從天津、北京、遼寧、江蘇等省市引進或自育水稻種質(zhì)資源59份。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?種植方式 ? ?每份資源同期播種、插秧，插3行區(qū)，每行9穴，每穴單株，株行距為13.3 cm×30 cm。田間管理同一般水田。

1.2.2 ? ?PCR檢測

1.2.2.1 ? ?DNA提取及引物的合成 ? ?在分蘗期對引進的水稻種質(zhì)資源，采用簡易SDS抽提法[5]提取單株水稻幼嫩葉片DNA。

按文獻檢閱[5，8，12]，設(shè)計與目的基因緊密連鎖的分子標記（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2.2.2 ? ?PCR擴增 ? ?PCR反應體系為20 μL，包括2 μL 10×Buffer（含20 mmol·L-1 Mg2+），10～30 ng 模板DNA，0.2 mmol·L-1 dNTP（2.5 mmol·L-1），正向和反向引物各0.2 μmol·L-1，1 U Taq酶，ddH2O補至20 μL。

PCR反應條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2.3 ? ?電泳 ? ?每管PCR擴增產(chǎn)物加2 μL的溴酚藍（含0.25%溴酚藍、40%蔗糖水溶液）混勻，點入8%聚丙酰胺變性測序凝膠上電泳，EB染色顯帶，記錄結(jié)果。其中含有目的基因帶型記為“+”，不含目的基因帶型的記為“-”。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?Stvb-i的PCR檢測

用攜帶抗條紋葉枯病Stvb-i基因的花育409作陽性植株對照，利用與Stvb-i基因緊密連鎖的分子標記對61份水稻種質(zhì)資源進行PCR檢測，其 PCR檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗條紋葉枯病Stvb-i基因的26份，分別為GQ-C2、GQ-C3、GQ-C4、GQ-C6、GQ-C9、海平稻選、07-15、SX867、LD30、LD12、ZD99、ZD9424、ZD88、XYG200、ZF9號、YJ689、H028、WYJ8號、XD3號、XD5號、XA931、ZD18、ZD19、LJ6號、LJ7號、LJ9號等。

2.2 ? ?Xa23的PCR檢測

用攜帶抗白葉枯病Xa23基因的中間材料BG152作陽性植株對照，利用與Xa23基因緊密連鎖的分子標記對61份水稻種質(zhì)資源進行PCR檢測，其 PCR檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗白葉枯病Xa23基因的7份，分別為皖香早稻、GQ-C6、GQ-C11、CA1、W21621、HD5號、W0625-5等。

2.3 ? ?Pi-1的PCR檢測

用攜帶抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118作陽性植株對照，利用與Pi-1基因緊密連鎖的分子標記對61份水稻種質(zhì)資源進行PCR檢測，其 PCR檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗稻瘟病Pi-1基因的27份，分別為GQ-C3、GQ-C5、GQ-C7、GQ-C8、GQ-C11、JD263、JD1007、LP-104、07-15、09XB107、W21621、LD12、WXJ21號、ZD99、ZD9424、W2845、WLJ1號、HD5號、YD8號、WYJ3號、WXJ14號、JH香稻、W0625-5、XA931、XXF2號、XF2號等。

2.4 ? ?水稻種質(zhì)資源的PCR檢測統(tǒng)計

62份水稻種質(zhì)資源的PCR檢測統(tǒng)計見表3。

從表3可以看出，62份水稻資源經(jīng)PCR檢測，從中篩選出含有一種抗病基因資源40份，占64.5%，其中Xa23呈陽性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈陽性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈陽性的材料有20份，占32.3%。含兩種抗病基因的資源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽性的材料有4份，Xa23和Stvb-i呈陽性的材料有1份，Pi-1和Stvb-i呈陽性的材料有5份。無目的基因的資源有12份，占19.4%。

3 ? ?討 論

選擇是水稻育種中的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的水稻育種選擇方法是對符合育種目標的農(nóng)藝性狀如株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、米質(zhì)、抗逆、抗病等進行直接選擇，即是通過個體表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇，而不是對基因型進行直接選擇。一般而言，這種方法對質(zhì)量性狀的選擇是有效的，對數(shù)量性狀的選擇，由于存在一因多效、多因一效等作用，個體的表現(xiàn)型與基因型存在較大的差異，尤其是水稻的抗病育種，通過田間表現(xiàn)型進行個體選擇的準確性較低[13-15]。分子標記輔助選擇技術(shù)是利用與目標基因緊密連鎖或共分離關(guān)系的分子標記對選擇個體進行目標區(qū)域以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個體，達到提高育種效率的目的。利用分子標記輔助選擇已應用于水稻抗病育種的實踐中，并取得一些實質(zhì)性進展。在聚合多個單一病害抗性基因方面：鄧其明等[16]利用分子標記將3個抗白葉枯病基因Xa21、Xa4和Xa23聚合到綿恢725中。秦剛等[17]利用分子標記技術(shù)將水稻白葉枯病基因Xa4、Xa23進行了聚合，并成功獲得聚合體。柳武革等[18]通過雜交、回交和自交并結(jié)合分子標記輔助選擇，將Pi-1、Pi-2基因?qū)霚孛艉瞬挥礕D-7S中，獲得5個攜帶兩個抗性基因的純合改良不育株系。陳紅旗等[19]利用分子標記技術(shù)聚合抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2、Pi-33，獲得6個金23B導入系。在聚合多個不同抗病基因方面：倪大虎等[20]利用分子標記輔助選擇聚合高抗白葉枯病的Xa23基因和高抗稻瘟病Pi9（t）基因，獲得了漢川基因的優(yōu)良株系L10～L13。倪大虎等[21]通過分子標記輔助選擇與傳統(tǒng)的雜交、自交相結(jié)合的方法，將抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白葉枯病的Xa21、Xa23基因聚合到同一株系中，經(jīng)多代大田或和溫室接菌鑒定、室內(nèi)標記選擇和田間農(nóng)藝性狀的篩選，獲得了4個三基因聚合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系。Sugiura等[22]利用分子標記輔助選擇將水稻條紋葉枯病基因Stvb-i和抗稻瘟病基因pb1聚合，選育出新的雙抗水稻品種愛知106。王軍等[23]利用分子標記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和抗條紋葉枯病基因Stvb-i，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗水稻新品系74121。

本研究利用分子標記輔助選擇技術(shù)，快速高效地篩選出了含廣譜顯性抗白葉枯病Xa23基因、抗稻瘟病Pi-1基因和抗條紋葉枯病Stvb-i基因的水稻種質(zhì)資源，從中篩選出含有一種抗病基因資源40份，占64.5%，其中Xa23呈陽性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈陽性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈陽性的材料有20份，占32.3%。含兩種抗病基因的資源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽性的材料有4份;Xa23和Stvb-i呈陽性的材料有1份;Pi-1和Stvb-i呈陽性的材料有5份，為今后作為水稻抗性育種的骨干親本，實現(xiàn)分子標記輔助選擇水稻抗病育種奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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