姜自紅

摘 ? ?要：以RAPD遺傳標(biāo)記為手段，對野生珍珠黃楊種群RAPD最佳反應(yīng)體系進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在36 ℃時珍珠黃楊有比較好的片段數(shù)量和片段亮度。此外，2.5 mmol·L-1 MgCl2，0.25 mmol·L-1 dNTP，0.3 μmol·L-1引物濃和2.0 U·（20 μL）-1 TaqDNA聚合酶構(gòu)成了珍珠黃楊RAPD擴(kuò)增的最佳組合反應(yīng)體系。

關(guān)鍵詞：珍珠黃楊;RAPD;反應(yīng)體系;正交設(shè)計

中圖分類號：S792.11 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.04.003

Research on Optimization of RAPD Reaction Systems for Buxus sinica var.parvifolia

JIANG Zi-hong

（Chuzhou Vocational and Technical College，Chuzhou，Anhui 239000，China）

Abstract： The genetic diversity of wild Buxus sinica var.parvifolia population were studied by random amplified polymorphic DNA（RAPD）.The results showed that the number and brightness of genetic segments were the best at 36 ℃. Meanwhile， 2.5 mmol·L-1 MgCl2， 0.25 mmol·L-1 dNTP， 0.3 μmol·L-1 primer and 2.0 U Taq DNA made a satisfactory RAPD technique system.

Key words： Buxus sinica var.parvifolia; RAPD;reaction system;the orthogonal design method

珍珠黃楊（Buxus sinica var.parvifolia）屬黃楊（B.sinica）變種，又名小葉黃楊、魚鱗黃楊、魚鱗木，具有生長慢、枝干茂密挺拔、樹型穩(wěn)定緊湊等特點，是制作袖珍園林的絕佳材料。主要產(chǎn)于江西廬山、福建崇安黃崗山、浙江龍蕩山、湖北神農(nóng)架、安徽歙縣清涼峰等地。

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）是美國科學(xué)家Williams和Welsh（1990 年）幾乎同時發(fā)展起來的一項技術(shù)，該技術(shù)具有簡便、迅速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物多樣性監(jiān)測、生物育種、遺傳定位等領(lǐng)域。RAPD在園林植物（楊樹、紅葉石楠、苦楝等）上的研究被廣泛報道，但關(guān)于 RAPD 標(biāo)記技術(shù)在珍珠黃楊上的應(yīng)用未見報道，本研究擬建立最優(yōu)珍珠黃楊RAPD反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展珍珠黃楊研究提供參考。

1 ? ?材料和方法

1.1 ? ?試驗材料

供試材料為：珍珠黃楊（安徽省黃山市歙縣清涼峰和江西省上饒市玉山縣三清山野生種群）。

1.2 ? ?試驗方法

采集野外珍珠黃楊葉片，利用改良CTAB—硅珠法[4]提取珍珠黃楊葉片中總DNA。

RAPD擴(kuò)增反應(yīng)隨機(jī)抽取一個野生珍珠黃楊的DNA樣本，利用隨機(jī)引物HY-36（CCCCCCTTAG），在MJ Research.Inc PTC-220型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增[5]。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，然后變性40 s，接著36 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)39次，最后在72 ℃延伸5 min。

在基本擴(kuò)增程序基礎(chǔ)上，試驗設(shè)計8個退火溫度：35，36，37，38，39，40，41，42 ℃。試驗采取每改變一個參數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL在含有0.5 μg·mL-1溴化乙錠（EB）染色液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠中電泳分析。

RAPD反應(yīng)條件設(shè)計：（1）Mg2+濃度分別設(shè)定為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mmol·L-1;（2）每種dNTP的最終濃度分別設(shè)定為0.10，0.15，0.2，0.25，0.3 mmol·L-1;（3）引物濃度分別設(shè)定為0.1，0.2，0.3， 0.4，0.5 μmol·L-1;（4）TagDNA聚合酶濃度分別設(shè)定為1.0，1.5，2.0，2.5 U。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?對珍珠黃楊RAPD最佳反應(yīng)體系溫度梯度的分析

由圖1可見，在幾個溫度條件下，野生珍珠黃楊擴(kuò)增均表現(xiàn)較好，根據(jù)扶芳藤最佳反應(yīng)體系[2]，以及本試驗結(jié)果，珍珠黃楊的片段數(shù)量和片段亮度在36 ℃時表現(xiàn)最好。

2.2 ? ?單因素方法篩選擴(kuò)增體系

2.2.1 ? ?Mg2+濃度對珍珠黃楊RAPD的影響 ? ?Mg2+是TagDNA聚合酶的激活劑。當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol·L-1時，條帶數(shù)少且條帶表現(xiàn)模糊，隨著Mg2+濃度增加，條帶數(shù)變得更加模糊，條帶數(shù)也逐漸減少，當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到2.5～3.0 mmol·L-1時，條帶反而亮度增加，條帶清晰度也較低濃度處理更明顯（圖2）。試驗結(jié)果顯示，隨著Mg2+濃度逐漸增加，條帶亮度也逐漸顯著，而弱帶反變得模糊，這可能是由于較高濃度Mg2+增加錯配率所導(dǎo)致。因此，珍珠黃楊RAPD擴(kuò)增較為適合的Mg2+濃度為2.5～3.0 mmol·L-1。

2.2.2 ? ?dNTP濃度對珍珠黃楊RAPD的影響 ? ?不同濃度的dNTP對擴(kuò)增結(jié)果的影響較為顯著（圖3）。試驗結(jié)果顯示， dNTP濃度為0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1時，擴(kuò)增條帶數(shù)和亮度差異不明顯，條帶數(shù)均表現(xiàn)少而模糊，部分條帶表現(xiàn)彌散現(xiàn)象。隨著dNTP濃度增加，擴(kuò)增條帶逐漸變得清晰，亮度增加，0.20 mmol·L-1時，效果最為明顯。當(dāng)濃度增至0.30 mmol·L-1時，主條帶數(shù)不增反減，這主要是因為dNTP濃度過高或過低都不利于珍珠黃楊RAPD的擴(kuò)增。

2.2.3 ? ?TagDNA聚合酶用量對珍珠黃楊RAPD的影響 ? ?試驗結(jié)果顯示，當(dāng)酶濃度為1.0 U·（20 μL）-1和1.5 U·（20 μL）-1時，條帶亮度集中但難于分辨，這主要是條帶不能有效擴(kuò)增所致，而2.0和2.5 U·（20 μL）-1的酶濃度條帶均均較清晰（圖4）。

2.2.4 ? ?引物濃度對珍珠黃楊RAPD的影響 ? ? 從圖5可知，當(dāng)引物濃度范圍為0.1～0.3 μmol·L-1，條帶的數(shù)量和亮度都有所遞增，而當(dāng)引物濃度高于0.5 μmol·L-1時同樣擴(kuò)增不完全，最后確定0.3 μmol·L-1的引物濃度較為適宜。

2.3 ? ?正交設(shè)計法篩選擴(kuò)增體系

第1次正交設(shè)計試驗結(jié)果顯示，第5，6，7，8， 9，10，16，17，18泳道的條帶比較清晰，擴(kuò)增效果比較理想，但也有條帶分不開（圖6）。

第2次正交設(shè)計的引物進(jìn)行了更換，結(jié)果顯示，第7，8，11，12，18泳道的條帶比較明亮，且清晰可辨，符合RAPD分析的要求（圖7）。

通過兩次正交設(shè)計，得出珍珠黃楊RAPD擴(kuò)增的最佳組合反應(yīng)體系為：MgCl2濃度2.5 mmol·L-1，dNTP濃度0.2 mmo1·L-1，引物濃度0.3 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶濃度2.0 U·（20 μL）-1。

2.4 ? ?3種反應(yīng)體系的比較

由圖8可見，各因素最優(yōu)水平的組合，最佳水平確定的原則為：當(dāng)某一影響因素的各濃度對擴(kuò)增片段數(shù)量有顯著影響時，可以利用擴(kuò)增片段最多的水平為最佳水平，片段平均亮度將不再考慮;如果某因素的各水平對擴(kuò)增片段數(shù)量影響不明顯時，則最佳水平用最大平均亮度作標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 ? ?最佳反應(yīng)體系的驗證

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，用引物HY-9對20份珍珠黃楊DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增（圖9）。該反應(yīng)體系下的每份DNA樣品均能明顯擴(kuò)增出DNA片段，適宜珍珠黃楊RAPD-PCR反應(yīng)，能夠應(yīng)用于珍珠黃楊遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的分析。

3 ? ?結(jié)論與討論

3.1 ? ?正交設(shè)計應(yīng)用于RAPD反應(yīng)體系建立的優(yōu)點

本試驗研究應(yīng)用L20（54）正交表，采取多次PCR擴(kuò)增，利用正交設(shè)計的量化分析，分析出Taq酶、Mg2+、隨機(jī)引物、dNTP 4種組分對RAPD擴(kuò)增的效應(yīng)，試驗結(jié)果構(gòu)建了穩(wěn)定性及重復(fù)性較好的RAPD反應(yīng)體系。單因素試驗相同次數(shù)的PCR擴(kuò)增雖可得到一個最優(yōu)體系，但缺點是不能研究交互作用，而正交設(shè)計在RAPD反應(yīng)體系建立的應(yīng)用可有效分析交互作用，并具有工作量小、數(shù)據(jù)分析簡單、信息量大等優(yōu)點[6-7]。

3.2 ? ?RAPD各組分對RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

關(guān)于RAPD體系中各組分對擴(kuò)增結(jié)果的影響及相關(guān)機(jī)理的研究已有很多報道[6-12]。而在本試驗中，不同濃度的影響因子擴(kuò)增出的片段數(shù)量也不同。Taq酶和Mg2+對凝膠上擴(kuò)增片段數(shù)量有顯著影響;不同濃度的Mg2+、dNTP和引物對擴(kuò)增片段亮度均有顯著影響，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[8-10]。試驗結(jié)果表明，dNTP和引物濃度對擴(kuò)增片段的數(shù)量影響不明顯，而Taq酶對擴(kuò)增片段亮度無顯著影響，結(jié)果與張彥萍、毛娟等研究結(jié)果不同[13-15]。相對于單一的試驗，正交設(shè)計結(jié)果包含了更多的信息。

綜上，通過對Mg2+，dNTP、引物和TaqDNA聚合酶用量等因子的不同濃度對擴(kuò)增條帶數(shù)量和亮度的研究，確定較理想的擴(kuò)增體系為：2.5 mmol·L-1 Mg2+濃度，0.25 mmo1·L-1 dNTP，0.3 μmol·L-1引物和2.0 U·（20 μL）-1 Taq DNA聚合酶。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張玉平，李丕軍，朱燕，等.楊樹RAPD標(biāo)記反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（13）：20-24.

[2] 陳羨德，陳禮光，陳珺，等.苦楝RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].西南林學(xué)院學(xué)報，2008，28（1）：43-47.

[3] 李妮，燕麗萍，劉翠蘭，等.紅葉石楠RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（34）：53-57.

[4] 蘇應(yīng)娟，王艇，楊維東，等.羅漢松屬植物DNA的提取和RAPD分析[J].中山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1998，37（4）：13-18.

[5] 潘青華，魯韌強(qiáng)，張開春.扶芳藤遺傳多樣性RAPD鑒定及類型劃分研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005，7（21）：90-93.

[6] 文曉鵬，鄧秀新.刺梨及其近緣種PCR試驗體系的建立及其優(yōu)化[J].果樹學(xué)報，2003，20（1）：35-39.

[7] 孫敏，喬愛民，王和勇，等.黃瓜DNA提取及其RAPD反應(yīng)體系的建立[J].種子，2004，23（6）：91-94.

[8] 張虎平，牛建新，馬兵鋼，等.核桃DNA的提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].石河子大學(xué)學(xué)報，2003，7（4）：267-270.

[9] 葉麗娟，祿久幸，楊秋生.蠟梅花瓣基因組DNA提取及RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（4）：299-303.

[10] 王家保，劉志媛，徐碧玉，等.用正交設(shè)計優(yōu)化荔枝RAPD反應(yīng)體系[J].武漢植物學(xué)研究，2005，23（4）：363-368.

[11] 葉凡，李開言，王亞芹.山茱萸RAPD反應(yīng)體系的正交優(yōu)化研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（4）：113-116.

[12] 孫朝霞，王海燕，王玉國.棗樹RAPD分析體系優(yōu)化研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008（4）：115-118.

[13] 張彥萍，劉海河.西瓜RAPD-PCR體系的正交優(yōu)化研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28（4）：51-53.

[14] 毛娟，趙長增，趙麗娟，等.扁桃基因組DNA提取及RAPD擴(kuò)增體系的建立[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，40（1）：17-21.

[15] 聶珍素，賴鐘雄，潘東明，等.橄欖基因組提取及擴(kuò)增條件優(yōu)化[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2005，1（2）：61-63.