柳琦 張汝芝

回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象與隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥治療的研究進(jìn)展

柳琦 張汝芝

隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥是一種遺傳性水皰病，由編碼Ⅶ型膠原的基因突變引起，對(duì)患者生活質(zhì)量有很大影響，目前治療多為對(duì)癥處理，迫切需要更好的治療方法。近年研究發(fā)現(xiàn)，隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者存在回復(fù)突變所致的片狀外觀正常皮膚。這種現(xiàn)象稱(chēng)為回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象，也稱(chēng)為天然基因治療。這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了回復(fù)細(xì)胞治療的可能性，即回復(fù)的角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)移植到受損皮膚。假如結(jié)合患者特異性誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞方法，可以有機(jī)會(huì)培養(yǎng)出大片健康皮膚移植物。另外，回復(fù)體來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞還可以分化為造血細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞，骨髓移植后歸巢到水皰區(qū)域，即“從皮膚到血細(xì)胞，再修復(fù)皮膚”。

營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解；皮膚疾病，水皰大皰性；鑲嵌現(xiàn)象；遺傳現(xiàn)象；多能干細(xì)胞；治療應(yīng)用

隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（RDEB）是一種少見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性皮膚病，其發(fā)生是由于編碼Ⅶ型膠原（Col17）的基因突變。Col17是基底膜帶處固著性原纖維的主要成分，而固著性原纖維參與表皮和其下真皮的黏附，使得皮膚功能完整。Col17的缺乏使得皮膚脆弱、水皰形成和糜爛［1］。因此，RDEB患者的皮膚和口腔、胃腸道、泌尿生殖道黏膜反復(fù)發(fā)生水皰，最終，水皰愈合留下瘢痕，導(dǎo)致嚴(yán)重的畸形。如果繼發(fā)感染，可導(dǎo)致敗血癥或多器官衰竭。轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌是RDEB患者最常見(jiàn)的死亡原因。目前，RDEB的治療主要是對(duì)癥治療和創(chuàng)傷護(hù)理，如止痛包扎、營(yíng)養(yǎng)支持和抗感染等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RDEB患者存在從未發(fā)生水皰的皮膚，這些皮膚中存在回復(fù)體（revertant）細(xì)胞，這些細(xì)胞有自發(fā)性矯正的 Col17A1 基因，并表達(dá) Col17［2］。

1 回復(fù)體及回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象

1.1 回復(fù)體：回復(fù)體來(lái)自拉丁語(yǔ)revertere，意味著回到原來(lái)的狀態(tài)，是一種軀體細(xì)胞內(nèi)致病突變的自發(fā)性矯正。發(fā)生機(jī)制包括逆突變（back mutation）、基因轉(zhuǎn)換、基因內(nèi)重組和第二位點(diǎn)突變等［3］。逆突變指致病突變變成野生型序列，恢復(fù)了野生型蛋白質(zhì)的翻譯。逆突變是隨機(jī)的，可能是基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致突變率增加，或者受環(huán)境因素的影響，如長(zhǎng)期暴露于紫外線?；蜣D(zhuǎn)換指遺傳物質(zhì)從供體序列到高度同源的受體序列的轉(zhuǎn)移，單向而非相互，導(dǎo)致受體序列部分或全部被供體序列替換，而供體序列保持不變?；騼?nèi)重組涉及遺傳物質(zhì)在供體和受體間相互轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其中一個(gè)子代細(xì)胞攜帶源于親代的兩種致病突變，而另一個(gè)回復(fù)性子代細(xì)胞不攜帶致病突變［4］。第二位點(diǎn)突變是一種自發(fā)補(bǔ)償性突變，發(fā)生在致病移碼的上游或下游，從而恢復(fù)閱讀框，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類(lèi)似于野生型或者盡管有功能但與野生型相比略有不同［5］。其他回復(fù)體機(jī)制還包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA滑動(dòng)?；貜?fù)可以發(fā)生在生殖細(xì)胞或體細(xì)胞內(nèi)，若發(fā)生在生殖細(xì)胞內(nèi)，則可以傳遞給子代。

1.2 回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象（revertant mosaicism，RM）：RM是指攜帶種系突變的細(xì)胞和已經(jīng)矯正種系突變的回復(fù)細(xì)胞共存。最初認(rèn)為RM是一種罕見(jiàn)的現(xiàn)象，但最近研究表明，RM并不少見(jiàn)。盡管RM首次在RDEB患者身上發(fā)現(xiàn)，但并不是RDEB所特有的，在其他疾病中亦可見(jiàn)，如原發(fā)性免疫缺陷病、范可尼貧血、魚(yú)鱗病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和酪氨酸血癥等［6］。據(jù)報(bào)道，Wiskott-Aldrich綜合征中RM的發(fā)生率達(dá)11%（30/272例），范可尼貧血中達(dá)18% （5/28例），非Herlitz交界性大皰性表皮松解癥（JEB-nH）中達(dá)35%（7/20例）［4］。RM似乎在再生器官系統(tǒng)的遺傳性疾病中很普遍，如皮膚、肝臟和造血系統(tǒng)等［7］，回復(fù)細(xì)胞類(lèi)型包括肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞（FB）和角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）等［5］。

2 RM在RDEB治療中作用

2.1 RDEB治療：RDEB尚無(wú)確定的治療方法，只是對(duì)癥處理和創(chuàng)傷護(hù)理，如止痛包扎、營(yíng)養(yǎng)支持和抗感染等。隨著對(duì)RDEB發(fā)病機(jī)制及遺傳基因等方面的深入研究，在治療方面已取得了重大進(jìn)展，包括基因治療（載體介導(dǎo)、基因重編程和基因沉默）、蛋白替代療法、細(xì)胞治療（系統(tǒng)應(yīng)用骨髓干細(xì)胞移植、間充質(zhì)干細(xì)胞、局部應(yīng)用KC和FB、培養(yǎng)/移植回復(fù)性細(xì)胞）以及應(yīng)用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）等［8］。雖然這些治療為患者帶來(lái)了希望，但大部分仍存在許多亟待解決的問(wèn)題，如病毒或非病毒介導(dǎo)的基因治療可能導(dǎo)致插入性突變或致癌作用，蛋白療法或異體細(xì)胞治療可能引起免疫排斥反應(yīng)等［9］。

1例36歲非Herlitz交界性大皰性表皮松解癥患者被成功移植LAMB3 cDNA（反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶）修正的表皮片，并維持功能性表皮，顯示遺傳性皮膚病體外基因治療的可行性，但該方法的安全性有待考證［10］。由于不能識(shí)別和靶向干細(xì)胞（能重建皮膚所有組分），基因?qū)胄实拖?，因此，基因矯正治療遺傳性皮膚病面臨很大困難。

2.2 皮膚RM的首次發(fā)現(xiàn)：首次報(bào)告的皮膚RM出現(xiàn)在28歲泛發(fā)性萎縮性良性大皰性表皮松解的女性患者，該報(bào)道首次表明了在遺傳性疾病中體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)換的作用。此例患者有兩個(gè)COL17A1突變的復(fù)合雜合子，即母系遺傳的移碼突變c.1706delA和父系遺傳的無(wú)義突變p.Arg1226X。臨床上出現(xiàn)多片外觀正常的皮膚，對(duì)稱(chēng)性分布于上肢的伸側(cè)。受累皮膚內(nèi)未檢測(cè)到Ⅶ型膠原，但在回復(fù)皮膚中，熒光顯微鏡觀察到Ⅶ型膠原的鑲嵌型。從回復(fù)體細(xì)胞提取DNA，進(jìn)行序列分析，顯示父系遺傳的突變，但不存在母系遺傳的突變，提示這些KC中的逆突變抵消了母系突變［11］。

2.3 回復(fù)體細(xì)胞移植治療 RDEB：Gostynski等［12］利用膠帶剝離法成功治療1例鑲嵌性Ⅶ膠原缺陷的JEB-nH患者?；顧z獲取患者左腕部表型正常的含回復(fù)體細(xì)胞的皮膚，胰酶消化獲得KC，接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，5周后獲得所需移植細(xì)胞片。作為受皮區(qū)的右股部，乙醚脫脂后，用聚丙烯酸脂膠帶粘貼，然后輕輕撕去粘有表皮的膠帶，露出無(wú)血的創(chuàng)面裸露的致密板，整個(gè)操作要求無(wú)菌。此方法簡(jiǎn)單有效、耐受性強(qiáng)、無(wú)痛。移植后4個(gè)月后隨訪，移植區(qū)上皮化，無(wú)瘢痕，有輕度線狀色素沉著，顯示移植成功，然而，因移植物中存留的回復(fù)體細(xì)胞少于3%，因此沒(méi)有達(dá)到功能性修復(fù)。

2.4 回復(fù)體細(xì)胞移植的局限性：研究表明，人們可以利用RM中的回復(fù)體細(xì)胞治療遺傳性水皰性皮膚病的創(chuàng)面，但是，由于以下可能的原因?qū)е乱浦参镏谢貜?fù)性細(xì)胞比例較低：①高度增殖的回復(fù)體細(xì)胞可能在RM中被逐漸耗竭；②分離出回復(fù)體細(xì)胞僅能有限傳代，即衍生的細(xì)胞數(shù)有限；③通常皮膚黏膜創(chuàng)傷不容易獲得，故局部創(chuàng)傷治療不能提供理想的治療方法［13］。因此，為解決這些問(wèn)題，人們推測(cè)，可以通過(guò)體外建立穩(wěn)定的干細(xì)胞來(lái)源，以分化為目標(biāo)KC，用于基因校正以達(dá)到治療此病的目的。

3 RM結(jié)合iPSC技術(shù)治療RDEB

RM結(jié)合iPSC技術(shù)治療RDEB，是一種新思路。將RDEB患者的回復(fù)性細(xì)胞重編程為基因矯正的iPSC，然后將這種回復(fù)性iPSC分化成目標(biāo)細(xì)胞，產(chǎn)生皮膚類(lèi)似物用于RDEB自身的全身或局部治療，可能降低RDEB患者的并發(fā)癥、提高生存期和改善生活質(zhì)量等。

3.1 患者特異性iPSC的研究現(xiàn)狀：Itoh等［14］從2例RDEB男患兒（年齡分別為13個(gè)月和1.5歲）的正常皮膚的真皮獲取FB，原代培養(yǎng)后，用c-MYC、SOX2、OCT4和KLF4因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生患者特異性iPSC（PS-iPSC），對(duì)PS-iPSC進(jìn)行突變和指紋分析后，體外分化培養(yǎng)，獲得KC，成功構(gòu)建了三維皮膚類(lèi)似物。作者的研究還顯示，這些PS-iPSC分化的FB也能產(chǎn)生Col17，提示FB也可作為治療RDEB的細(xì)胞來(lái)源之一［15］。既然 FB和 KC均能分泌Col17，意味著這兩種細(xì)胞的表型似乎都與RDEB發(fā)病有關(guān)。Tolar等［16］從3例RDEB患者的正常皮膚中獲取FB和KC，并成功重編程為PS-iPSC，這些細(xì)胞肌內(nèi)注射給免疫缺陷鼠，可生成畸胎瘤；體外可分化成造血細(xì)胞；用包含人Col17A1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該P(yáng)S-iPSC，可獲得基因修正。

3.2 PS-iPSC的潛能：PS-iPSC的獲取使得人們更好地理解在上皮干細(xì)胞、祖細(xì)胞及其子代細(xì)胞發(fā)育中，Col17缺陷引發(fā)的下游事件。RDEB患者皮膚FB和KC來(lái)源的PS-iPSC體外可分化成造血和非造血細(xì)胞。這些研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了RDEB來(lái)源的PS-iPSC的潛能：①RDEB來(lái)源的PS-iPSC顯示疾病相關(guān)表型，提供研究RDEB和相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制的模型［15］，與分化的人類(lèi)細(xì)胞和RDEB動(dòng)物模型相比，PS-iPSC更有優(yōu)越性，提供機(jī)會(huì)更深入分析Col17缺陷的細(xì)胞效應(yīng)，不依賴(lài)于糜爛和水皰形成時(shí)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的繼發(fā)效應(yīng)；②使用已知基因糾正的PS-iPSC（來(lái)自RM）產(chǎn)生自體造血移植物，用作系統(tǒng)治療；③產(chǎn)生皮膚細(xì)胞治療RDEB患者皮膚和黏膜的損傷［13］。這一技術(shù)在理論上可以獲得用之不竭的患者特異性回復(fù)性細(xì)胞，無(wú)需基因矯正，能夠克服基因治療、異體細(xì)胞療法等治療方案可能帶來(lái)的弊端。

3.3 RM結(jié)合PS-iPSC應(yīng)用的受限因素：RM結(jié)合PS-iPSC治療RDEB的潛在風(fēng)險(xiǎn)與下列因素有關(guān)：①用胚胎干細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子重編程，可能有基因毒性，重編程方法使得突變基因增強(qiáng)（如病毒載體輸入）；②獲得和維持多能表型和種系特異性細(xì)胞命運(yùn)的可信度；③分化的PS-iPSC子代的純度，最少化或避免未分化和潛在致瘤iPSC的存在［16］。

4 結(jié)語(yǔ)

RM這一天然基因治療為RDEB帶來(lái)了曙光，但因其明顯的局限性：回復(fù)性KC和干細(xì)胞數(shù)量有限，無(wú)法真正改善患者的生活質(zhì)量，因此，僅憑借RM治療RDEB仍然十分困難。隨著研究的進(jìn)展，人們利用嘗試RM聯(lián)合iPSC技術(shù)，將Col17A1回復(fù)性KC或FB誘導(dǎo)為功能性iPSC，然后將此功能性iPSC分化成目標(biāo)細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)增，用于局部或全身治療。隨著對(duì)RDEB的不斷深入研究和分化、移植、iPSC等技術(shù)的不斷成熟，RM聯(lián)合iPSC技術(shù)可能為未來(lái)治療RDEB提供一種有前景的治療方法。

［1］ Bruckner-Tuderma n L.Dystrophic epidermolysisbullosa:pathogenesis and clinical features ［J］.Dermatol Clin,2010,28（1）:107-114.

［2］ Almaani N,Nagy N,Liu L,et al.Revertant mosaicism in recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.J Invest Dermatol,2010,130（7）:1937-1940.

［3］ Pasmooij AM,Nijenhuis M,Brander R,et al.Natural gene therapy may occur in all patients with generalized non-Herlitz junctional epidermolysis bullosa with COL17A1 mutations ［J］.J Invest Dermatol,2012,132（5）:1374-1383.

［4］ Lai-Cheong JE,McGrath JA,Uitto J.Revertant mosaicism in skin:natural gene therapy ［J］.Trends Mol Med,2011,17（3）:140-148.

［5］ Pasmooij AM,Jonkman MF,Uitto J.Revertant mosaicism in heritable skin diseases:mechanisms of natural gene therapy［J］.Discov Med,2012,14（76）:167-179.

［6］ Wada T,Candotti F.Somatic mosaicism in primary immune deficiencies ［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol,2008,8（6）:510-514.

［7］ Jonkman MF,Pasmooij AM.Realm of revertant mosaicism expanding［J］.J Invest Dermatol,2012,132（3 Pt 1）:514-516.

［8］ Hünefeld C,Mezger M,Kern JS,et al.One goal,different strategies--molecular and cellular approaches for the treatment of inherited skin fragility disorders［J］.Exp Dermatol,2013,22（3）:162-167.

［9］ Cutlar L,Greiser U,Wang W.Gene therapy:pursuing restoration of dermal adhesion in recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.Exp Dermatol,2014,23（1）:1-6.

［10］ De Luca M,Pellegrini G,Mavilio F.Gene therapy of inherited skin adhesion disorders:a critical overview ［J］.Br J Dermatol,2009,161（1）:19-24.

［11］ Jonkman MF,Scheffer H,Stulp R,et al.Revertant mosaicism in epidermolysis bullosa caused by mitotic gene conversion ［J］.Cell,1997,88（4）:543-551.

［12］ Gostynski A,Deviaene FC,Pasmooij AM,et al.Adhesive stripping to remove epidermis in junctional epidermolysis bullosa for revertant cell therapy［J］.Br J Dermatol,2009,161（2）:444-447.

［13］ Tolar J,McGrath JA,Xia L,et al.Patient-specific naturally gene-reverted induced pluripotentstem cells in recessive dystrophic epidermolysis bullosa ［J］.J Invest Dermatol,2014,134（5）:1246-1254.

［14］ Itoh M,Kiuru M,Cairo MS,et al.Generation of keratinocytes from normal and recessive dystrophic epidermolysis bullosainduced pluripotent stem cells ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108（21）:8797-8802.

［15］ Itoh M,Umegaki-Arao N,Guo Z,et al.Generation of 3D skin equivalents fully reconstituted from human induced pluripotent stem cells （iPSCs）［J/OL］.PLoS One,2013,8 （10）:e77673［2013-10-11］. http://www.plosone.org/article/info% 3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0077673.

［16］ Tolar J,Xia L,Riddle MJ,et al.Induced pluripotent stem cells from individuals with recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.J Invest Dermatol,2011,131（4）:848-856.

Revertant mosaicism and treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Liu Qi,Zhang Ruzhi.Third Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 213003,China

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa （RDEB）,an inherited blistering disease caused by mutations in the gene encoding typeⅦ collagen,has a strong impact on patients′quality of life.At present,it is mainly managed by symptomatic treatment,and more effective therapeutic approaches are urgently needed.Recent studies have found the presence of patches of normal-looking skin caused by reverse mutations in patients with RDEB.This phenomenon is called revertant mosaicism,also known as “natural gene therapy”.This finding offers the possibility of revertant cell therapy,namely,transplantation of revertant keratinocytes culturedin vitroonto damaged skin.The combination with patient-specific induced pluripotent stem cells（iPSCs） makes it possible to harvest large sheets of healthy skin graft.Moreover,iPSCs derived from revertant keratinocytes can differentiate into hematopoietic cells and mesenchymal stem cells,which can home to blistering areas after bone marrow transplantation,namely,“from skin to blood cells,then to repair of skin”.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Skin diseases,vesiculobullous;Mosaicism;Genetic phenomena;Multipotent stem cells;Therapeutic uses

Zhang Ruzhi,Email:zhangruzhi628@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.012

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171516）

213003蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院

張汝芝,Email:zhangruzhi628@163.com

本文主要縮寫(xiě)：RDEB：隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥，RM：回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象，F(xiàn)B：成纖維細(xì)胞，KC：角質(zhì)形成細(xì)胞，iPSC：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞

2014-05-09）