張觀坡 柏 愚 李兆申

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三位高發(fā)的癌癥，同時也是癌癥致死的第四大病因［1］。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是減少CRC發(fā)病率和病死率的有效手段。結(jié)腸鏡檢查是目前篩查CRC的金標準，美國50歲以上人群的結(jié)腸鏡篩查率只有29.8%～55.2%［2］，中國適齡人群的結(jié)腸鏡受檢率也偏低［3］。此外，結(jié)腸鏡檢查存在一定的漏檢率，如結(jié)腸腺瘤的漏檢率可達6%～12%，而CRC的漏檢率亦可達5%［4］。因此，為了提高適齡人群尤其是CRC高?；颊叩暮Y查率，迫切需要新的篩查手段，如尋找血液或糞便中CRC的腫瘤標志物。隨著分子生物學以及新一代測序技術(shù)的發(fā)展，研究者從患者血液及糞便中發(fā)現(xiàn)了越來越多的腫瘤標志物，其中具有較高敏感度和特異度的DNA和RNA具有廣闊的應用前景。

1 DNA

血中游離DNA簡稱循環(huán)核酸，是指循環(huán)血中游離于細胞外部分的已降解的機體內(nèi)源性DNA，可以來源于腫瘤細胞的壞死、凋亡或直接分泌［5］。循環(huán)核酸一般只有70～200 bp［6］，在血液中的含量極其微少使得分離極其困難，但隨著測序技術(shù)的不斷進步，目前已可以高度敏感及特異地檢測血液中微量的循環(huán)核酸，從而為尋求新的早期無創(chuàng)篩查CRC的標志物提供了可能［7］。

1.1 異常DNA甲基化

DNA甲基化對細胞的正常分化和胚胎的發(fā)育極其重要，但是異常的DNA甲基化卻與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早在1983年，F(xiàn)einberg等［8］就報道了DNA異常甲基化和腫瘤發(fā)生的關(guān)系。DNA甲基化可以沉默基因的表達，如抑癌基因啟動子CpG島的高甲基化可以引起DNA雙鏈更緊密地折疊而影響轉(zhuǎn)錄，從而導致癌癥［9-10］。很多研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的早期事件相關(guān)，因而其被認為是一個潛在的早期腫瘤檢測指標［11-12］。

目前，僅有少數(shù)幾個DNA甲基化的標志物實現(xiàn)商業(yè)化。如ColoVantage○R是一種基于檢測血漿中SEPT9基因甲基化的試劑盒，其對CRC的總體敏感度達90%，其中對1期和2期CRC的敏感度為87%，對3期和4期CRC的敏感度達100%［13］。Epi proColon○R2.0亦是一種基于檢測血漿中SEPT9基因甲基化的試劑盒，其對CRC的總體敏感度達95.6%，其中對1期CRC的敏感度為84%，對2～4期CRC的敏感度亦達100%；使用此試劑盒時，其在左半結(jié)腸的陽性率達96.4%，在右半結(jié)腸的陽性率達94.4%［14］。ColoSureTM則是一種基于檢測糞便中vimentin基因甲基化的試劑盒，其對CRC的敏感度為38%～88%，該試劑盒被推薦與結(jié)腸鏡檢查聯(lián)合篩查CRC［15］。

不過大部分DNA甲基化的生物標志物尚處于科研及臨床試驗階段。在21世紀初，Nakayama等［16］和 Lecomte等［17］檢測到，腫瘤抑制基因 p16的啟動子高甲基化在CRC患者血液中的陽性率分別為68%和69%。而Grady等［18］檢測到hMLH1啟動子異常甲基化在CRC患者血清中的陽性率僅為47%。Oh等［19］研究發(fā)現(xiàn)，異常SDC2甲基化在139例Ⅰ～Ⅳ期CRC患者腫瘤組織中的表達率為97.8%，而血清中SDC2甲基化的敏感度為87.0%，特異度為95.2%，特別是在Ⅰ期CRC患者的敏感度可高達92.3%，使其可以作為潛在的早期檢測CRC的標志物。而對于糞便來源的DNA，由于各研究對標本處理的方法存在更大的異質(zhì)性，使得目前研究結(jié)果并不令人滿意。如 Gl?ckner等［20］發(fā)現(xiàn)，TFPI2的異常甲基化在CRC腺瘤的檢出率為97%，在Ⅰ～Ⅳ期CRC患者腫瘤組織中更高達99%；而其在Ⅰ～Ⅲ期CRC患者的糞便標本中敏感度為76%～89%，特異度為79%～93%。其他學者在CRC患者糞便中檢測到的NDRG4啟動子及轉(zhuǎn)錄因子GATA4等基因的異常甲基化雖然敏感度僅為51%～53%，但特異度可達93%～100%。即便如此，這些研究仍需擴大樣本以進一步驗證。

鑒于檢測單個基因的局限性，許多學者采用聯(lián)合檢測多基因甲基化的策略以提高敏感度和特異度。Lind等［21］聯(lián)合檢測血清中 CNIP1、FBN1、INA、SNCA、MAL和SPG20，發(fā)現(xiàn)≥2個以上上述基因的啟動子出現(xiàn)高甲基化，其敏感度在腺瘤和CRC中分別為93%和94%，特異度可達98%。Alhquist等［22］則聯(lián)合檢測了糞便中骨形成蛋白3（BMP3）、NDRG4、vimenti、TFPI2、突變型 KRAS、β-肌動蛋白（β-actin）等基因的甲基化，其對CRC的敏感度可達87%。相信隨著研究的進展，將來一定會出現(xiàn)更多的優(yōu)化組合標志物，可進一步提高CRC早期檢測的敏感度和特異度。

1.2 異常的腫瘤DNA突變

在結(jié)直腸正常上皮細胞由腺瘤向腺癌的發(fā)生過程中，突變的基因如KRAS、p53、APC可以在血循環(huán)中被檢測到［17，23-24］，但與野生型 DNA 相比，含量非常低［25］。例如，Diehl等［24］研 究 發(fā)現(xiàn)，59% 的CRC患者（n＝56）血漿中可以檢測到突變的APC，但其中晚期CRC患者的血漿中突變的APC基因僅占總APC基因的1.9%～27%，而早期CRC患者則僅有0.01%～0.12%。即便使用直接測序技術(shù)，在野生型DNA的背景中，其突變信號的檢出率也低于25%［26］。因此，目前的技術(shù)尚難以開發(fā)低成本且具高敏感度的方法用來檢測所有體細胞突變，作為早期檢測CRC的指標。

1.3 微衛(wèi)星改變

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。雜合性是指在同源染色體上的一個或多個位點上有不同等位基因存在的狀態(tài)。微衛(wèi)星改變包括MSI和失去雜合性，與腫瘤的發(fā)生、進展相關(guān)，因而被認為可作為潛在的腫瘤檢測指標［27］。Hibi等［28］研究發(fā)現(xiàn)，80%的原發(fā)性 CRC 中存在MSI或失去雜合性的改變，但無1例出現(xiàn)在相應患者的血清DNA中?？傮w上，在檢測早期CRC時，微衛(wèi)星改變表現(xiàn)出較低的敏感度和特異度，目前尚難以作為早期檢測CRC的指標。

1.4 循環(huán)線粒體DNA

在每個細胞中均有數(shù)以百計的線粒體DNA拷貝，而正是由于其多拷貝的特性，線粒體DNA通常表現(xiàn)出異質(zhì)性。對腫瘤細胞而言，除了表現(xiàn)出與特定腫瘤相關(guān)的異質(zhì)性之外，還存在D-襻區(qū)域的變異［29］。Hibi等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在早期 CRC中，近9%（7／77）的CRC組織存在線粒體DNA的改變，但在這7例患者中，僅有1例的血清中存在線粒體DNA的改變。鑒于線粒體DNA在早期CRC中極低的陽性率，更多的研究將重點放在其與CRC晚期轉(zhuǎn)移的關(guān)系上。

2 RNA

通常認為RNA是一種高度不穩(wěn)定、容易降解的小分子物質(zhì)，但隨著研究的深入，許多研究證實RNA可以穩(wěn)定的存在于外周血中，這可能與其在血液中與蛋白質(zhì)或磷脂相結(jié)合，從而可以抵御RNA酶降解有關(guān)［31］。這些RNA包括編碼RNA［如信使RNA（mRNA）］及非編碼 RNA［如微小 RNA（microRNA）和長鏈非編碼 RNA（lncRNA）］［32-33］。不僅如此，這些RNA還可以在血漿或血清中被抽提及檢測出來［34-35］作為潛在的腫瘤標志物［36］。

2.1 mRNA

mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的、攜帶遺傳信息的能指導蛋白合成的一類單鏈核糖核酸。mRNA的研究策略是通過分析mRNA芯片特征繼而使用RT-PCR進行確證。

Tsouma等［37］通過提取CRC患者的外周血RNA并使用多重RT-PCR技術(shù)分析癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白20（CK20）、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA的改變，發(fā)現(xiàn)其陽性率分別為95.5%、78.4%和19.3%，并且其與疾病分期及術(shù)前CEA水平呈正相關(guān)。但目前關(guān)于mRNA和CRC的研究資料不多，可能與芯片技術(shù)逐漸被新一代測序技術(shù)取代有關(guān)。

2.2 microRNA

microRNA是一類進化上保守的非編碼單鏈小RNA分子，長度約為18～25個核苷酸，其最早是由Lee等［38］于1993年在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的。microRNA通過與其靶mRNA上的互補序列的堿基配對，進而引起轉(zhuǎn)錄抑制或mRNA降解［39］。可以由一個microRNA調(diào)控多個目的基因的表達，也可以由幾個microRNA調(diào)節(jié)同一個基因的表達［40］。異常的microRNA表達可以作為早期腫瘤的診斷標志物。

Michael等［41］于2003年最先分析了28種microRNA在人CRC組織與正常黏膜組織中的差異表達，發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145具有顯著差異。而Ng等［42］于2009年首次使用實時PCR技術(shù)篩選了CRC患者血漿中95種microRNA的變化，其中miR-17-3p和miR-92顯著升高，其敏感度為89%、特異度為70%。至今為止，有多達數(shù)十種血漿中的microRNA被提出來作為CRC的腫瘤標志物，其敏感度為68%～91%、特異度為41%～95%。在這些microRNA中，原癌基因性microRNA如miR-17、miR-21、miR-31、miR-92a、miR-106a、miR-106b、miR-135a、miR-135b和 miR-155的表達上調(diào)與CRC相關(guān)，而抑癌基因性microRNA如miR-143、miR-145 miR-148a、miR-148b和miR-215的表達下調(diào)亦與CRC相關(guān)。另一方面，在CRC血循環(huán)中表達上調(diào)的 miR-15b、miR-17-5p、miR-18a、miR-142-3p、miR-195、miR-331、miR-532-5p、miR-532-3p、miR-652以及表達下調(diào)的miR-601、miR-760被認為可以鑒別進展期腺瘤和CRC，并且miR-15b、miR-17-3p、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-29a和miR-92a都已被超過一個研究小組報道過。盡管如此，仍有相當多的研究結(jié)果未被其他研究者所重復，如Faltejskova等［43］的研究并沒有證實miR-17-3p、miR-29a、miR-92a、和 miR-135b可作為CRC的腫瘤標志物。這些不一致的研究結(jié)果可能是由于實驗設計、患者來源以及實驗條件不同引起的。因此，將來需要確立標準的實驗控制條件后進行更大范圍的多中心研究，才可能確定哪些microRNA可以作為CRC腫瘤標志物。

2.3 lncRNA

lncRNA為長度超過200 nt的RNA分子，其不直接編碼蛋白，而是以RNA的形式在多個層面上調(diào)控基因的表達水平。lncRNA最初被認為是“垃圾RNA”，但隨著研究的深入，lncRNA成為近年來生命科學研究的前沿和熱點，其對基因的調(diào)節(jié)及細胞的功能發(fā)揮著極其重要的作用［44］，尤其是在腫瘤抑制及生成中的作用，因此lncRNA作為癌癥潛在的腫瘤標志物也越來越受到重視［45］。

目前僅有的研究都是以CRC組織作為標本。如Ge等［46］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌相關(guān)lncRNA轉(zhuǎn)錄因子1在CRC組織中上調(diào)，但附近的正常組織為陰性表達。Zhai等［47］研究發(fā)現(xiàn)，長的基因間非編碼RNA-p21在CRC組織中表達上調(diào)，并且與腫瘤進展相關(guān)。Ling等［48］發(fā)現(xiàn)lncRNA-CCAT2在CRC組織中高度表達，并且可以促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和染色 體 的 不 穩(wěn) 定。Kogo 等［49］發(fā) 現(xiàn) lncRNAHOTAIR的表達在晚期CRC的組織中表達較高。Xu等［50］則發(fā)現(xiàn)lncRNA-人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（MALAT-1）在CRC組織中表達下調(diào)。鑒于lncRNA在基因調(diào)控中的重要作用以及隨著下一代測序技術(shù)的進步及普及，將來會有更多的血循環(huán)lncRNA和CRC相關(guān)研究出現(xiàn)。

3 結(jié)語

早期篩查CRC是減少CRC發(fā)病率及病死率的最有效手段。雖然目前最有效的篩查方法仍是結(jié)腸鏡檢查，但考慮到其較低的受檢率，迫切需要新的篩查手段，其必須滿足價格低廉、低風險、高敏感度并且不需要繁瑣的腸道準備等優(yōu)點，才可以提高公眾尤其是高風險人群進行CRC篩查的意愿。通過分析患者血液或糞便中DNA或RNA的變化，可以有效尋找到高敏感度及特異度的早期CRC腫瘤標志物。雖然在目前的研究中，這些腫瘤標志物尚難以廣泛應用于臨床，但隨著下一代測序技術(shù)的進步及普及，相信可以尋找到更加特異的早期CRC腫瘤標志物。

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