李悅明，徐建春，孫慧彬，于水見，李霞

（青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東青島 266400）

利用胞內(nèi)核磁共振法快速篩選高產(chǎn)DHA裂殖壺菌的研究

李悅明，徐建春，孫慧彬，于水見，李霞

（青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東青島 266400）

采用化學(xué)試劑亞硝基胍和紫外結(jié)合的方式對生產(chǎn)用裂殖壺菌進行誘變。通過核磁共振法快速原位檢測約三百個突變株的胞內(nèi)油脂含量和DHA占總脂肪酸比例，綜合考慮兩個指標，篩選出性狀較優(yōu)良的10余個突變株。通過進一步對其各項指標的仔細檢測，最終篩選得到一株DHA高產(chǎn)突變菌株。突變株生物量較野生菌株沒有變化，油脂含量為68%，DHA占總油脂比例57%，比出發(fā)菌株分別提高17%和14%，該突變菌株被命名為Aurantiochytrium sp. KYX-01，其性狀優(yōu)異，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)DHA油脂。

裂殖壺菌；胞內(nèi)核磁共振；誘變育種；二十二碳六烯酸（DHA）

前言

二十二碳六烯酸（DHA）屬于n-3系列多不飽和脂肪酸，含有多個典型的“戊烯雙鍵”，化學(xué)性質(zhì)活潑。DHA具有很重要的生理功能，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、促進智力發(fā)育、保護視力、治療心血管疾病和抗腫瘤等方面[1]。DHA屬于人體必需多不飽和脂肪酸，人體不能從頭合成，只能通過食物獲取。DHA來源主要是魚油和藻油。由于魚油存在污染、資源短缺等缺點，藻油DHA越來越受到人們重視。工業(yè)化生產(chǎn)藻油DHA主要菌株是寇氏隱甲藻和裂殖壺菌。1996年Nakahara等采用海水—松花粉誘捕法從珊瑚礁附近海水中首次分離得到裂殖壺菌[2]，目前已經(jīng)有很多株裂殖壺菌用于DHA工業(yè)生產(chǎn)。但是野生菌株產(chǎn)量偏低，后代性狀單一，難以滿足越來越高的工業(yè)需求。目前主要的裂殖壺菌新菌株篩選手段依然是誘變篩選。其中，誘變包括射線輻照、激光、紫外線等物理手段和亞硝基胍、硫酸二乙酯、疊氮化鈉等化學(xué)試劑誘變，兩者各有優(yōu)勢，混合使用可能收到意想不到的效果。本研究使用亞硝基胍和紫外結(jié)合的誘變方式，通過核磁共振作為初篩手段，快速原位檢測油脂含量和油脂組成，進而進行復(fù)篩，得到一株油脂含量68%，DHA含量占總油脂含量57%的菌株，適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

出發(fā)菌株裂殖壺菌SD116為生產(chǎn)用菌株[3]。種子培養(yǎng)基配方為（g/L）：葡萄糖60，酵母粉20，海水晶15。將-80°C保藏的甘油菌在種子培養(yǎng)基中25 °C生長48 h后，將菌液按10%的接種量接入新鮮的裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25°C、轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下培養(yǎng)4 d。在離心機中以轉(zhuǎn)速4500 r/min離心10 min后收集菌體。

1.2 亞硝基胍及紫外誘變

將生長至對數(shù)中期的裂殖壺菌4500 r/min離心10 min收集菌體，無菌水洗滌兩次后用磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，0.1 mol/L）重懸。分別加入終濃度為10 mg/L的亞硝基胍，處理10、20、30、40、50和60 min。處理后，稀釋至合適倍數(shù)進行平板計數(shù)，確定誘變劑量。紫外誘變?nèi)缦拢簩⒕合♂屩梁线m濃度，涂布平板，紫外燈下照射10～200 s，置于暗處培養(yǎng)2 d，繪制致死曲線。

1.3 核磁共振初步篩選

樣品制備：將油脂和氘代氯仿按體積比2∶5混合，置于核磁管中。胞內(nèi)NMR樣品制備：將培養(yǎng)的菌液在6500 r/min離心，將菌體重懸于緩沖液（50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.0，200 mmol/L氯化鈉）中，再反復(fù)離心重懸3～4次。最后一次將菌體沉淀重懸于等體積的緩沖液中，加10%重水，置于核磁管中。核磁共振譜儀為Bruker 600 MHz譜儀，探頭為TCI超低溫探頭。對提取的油脂樣品，采用標準的一維氫譜脈沖程序和氫去耦的碳譜脈沖程序采集氫譜和碳譜。對胞內(nèi)NMR樣品，采用預(yù)飽和水峰壓制的氫譜脈沖程序采集氫譜，采用氫去耦的碳譜脈沖程序采集碳譜。使用Topspin 3.1軟件對譜圖進行處理和分析[4]。

1.4 胞內(nèi)油脂提取

油脂提取方法基本參照文獻中的方法進行[5]。首先將收集得到的菌體進行冷凍干燥。然后稱取40～50 mg凍干粉，加入300 μL 6 mol/L HCl，室溫放置30 min，再沸水浴5 min。冷卻后的溶液中加入900 μL氯仿-甲醇（2∶1，V/V），蝸旋振蕩混勻，然后在離心機中10000 r/min離心5 min，收集下層液體。收集的液體中加入等體積的飽和氯化鈉，蝸旋振蕩混勻，在離心機中10000 r/min離心5 min，收集下層液體。將收集的液體35°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，置于50°C真空干燥，得到提取的油脂。

1.5 脂肪酸組成測定

脂肪酸組成測定參照Xiao等的方法[6]。油脂加入1 mL氯仿，2.5 mL硫酸甲醇溶液（2%，V/V）置于85°C反應(yīng)3 h后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，1 mL正己烷，振蕩混合后取有機相部分進行氣相色譜測定。氣相色譜測定條件：采用Agilent-GC7890 A氣相色譜儀，色譜柱為HP-INNOWax （30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為高純氮，設(shè)定程序升溫為100°C保持1 min，然后每分鐘升溫15°C至240°C，240°C保持10 min，氫離子火焰檢測器（FID）溫度為260°C。恒流控制，氮氣流量為30 mL/min，氫氣流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min，進樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 誘變劑量確定

在進行誘變之前，需要對誘變劑的使用劑量進行確定，在合適的致死率下進行誘變，以獲得盡可能大的正向突變頻率。對于亞硝基胍使用劑量的確定，實驗結(jié)果如圖1（a）所示?？梢钥闯觯S著處理時間的延長，致死率在不斷上升。在前40 min時，致死率幾乎是直線上升，之后上升幅度大幅下降，最終致死率達到約100%。眾所周知，亞硝基胍屬于效果顯著的化學(xué)誘變劑，致死率太高反而效果不佳。所以，我們把誘變劑量確定在致死率為75%時，對應(yīng)的誘變劑使用劑量為100 mg/L，處理時間30 min。

紫外誘變致死率曲線如圖1（b）所示。與亞硝基胍處理結(jié)果相似，隨著照射時間延長，裂殖壺菌致死率不斷升高。紫外誘變效率遠低于亞硝基胍，所以其使用劑量我們確定在致死率為95%時，對應(yīng)條件為紫外照射時間為25 s左右。

圖1 誘變致死曲線

2.2 亞硝基胍誘變及初步篩選

采取前述誘變劑進行亞硝基胍化學(xué)誘變。待菌落長出后，進行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)后采用核磁共振的方法，快速檢測胞內(nèi)油脂含量和油脂組成成分。共計初步篩選300株，其中73株胞內(nèi)油脂含量有所上升，上升超過10%的有12株，DHA含量升高的有11株。綜合油脂含量和DHA含量，進行氣相色譜測定，最終確定一株誘變菌株作為下一步誘變的出發(fā)菌株。其性狀為：4 d搖瓶發(fā)酵，胞內(nèi)油脂含量為60%，其中DHA占總油脂比例的55%。

2.3 紫外誘變及篩選

對化學(xué)誘變得到的出發(fā)菌株進行紫外誘變，誘變劑劑量為紫外照射25 s。再次利用核磁共振的方法進行檢測，胞內(nèi)油脂含量上升的有13株，DHA含量升高的有5株。根據(jù)此次結(jié)果進行兩輪搖瓶復(fù)篩，最終得到一株油脂含量為68%的菌株，DHA占總油脂比例的57%，命名為Aurantiochytrium sp.KYX-01。相對于原始出發(fā)菌株，油脂含量提高17%，DHA比例提高14%。篩選菌株KYX-01與原始菌株的脂肪酸組成變化如表1所示?？梢钥闯?，油脂中除了DHA外還有DPA （C22:5 n-6），軟脂酸（C16:0），硬脂酸（C18:0）等成分。相比較出發(fā)菌株，變化比較明顯的是軟脂酸（C16:0）比例有較大幅度下降，DPA和DHA有較大幅度提升。

表1 篩選菌株與原始菌株脂肪酸組成比較

3 討論

目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)制備DHA所使用的菌株為裂殖壺菌、寇氏隱甲藻和吾肯氏菌。其中，裂殖壺菌和寇氏隱甲藻使用最為廣泛。而裂殖壺菌由于其生長迅速，營養(yǎng)需求簡單，可以高密度發(fā)酵等特點備受關(guān)注。在生產(chǎn)過程中，裂殖壺菌可以達到的生物量（DCW）、胞內(nèi)油脂含量和DHA占總脂肪酸的比例是最重要的三個指標。前兩個決定了DHA油脂的產(chǎn)量，而DHA占脂肪酸的比例決定了油脂的品質(zhì)。目前，針對這三個指標，許多研究組都在進行各方面的努力。Ren等[7]從代謝工程角度改進菌株，Zhu等[8]從培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件等角度進行研究。目前，已經(jīng)公開報道的適用于工業(yè)生產(chǎn)的裂殖壺菌菌株有SR21[9]、BL10[10]等。這些菌株性狀差異不明顯，油脂含量和DHA占總脂肪酸比例均不夠理想，亟待開發(fā)新的性狀優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

全世界范圍內(nèi)，關(guān)于裂殖壺菌生理生化及代謝工程改造手段等研究相對匱乏，所以傳統(tǒng)的誘變?nèi)匀皇沁x育優(yōu)良性狀裂殖壺菌的重要手段。本研究中，選用化學(xué)和物理誘變劑相結(jié)合的方法，篩選得到了一株適合工業(yè)生產(chǎn)的菌株。首先采用亞硝基胍作為誘變劑進行誘變，獲得優(yōu)良生產(chǎn)性狀。眾所周知，亞硝基胍（NTG）是公認的效果顯著的化學(xué)誘變劑，其誘變原理是易取代DNA分子中活潑的氫原子，使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時導(dǎo)致堿基配對錯誤而引起突變。根據(jù)經(jīng)驗，亞硝基胍在低致死率下，有較好的正向突變頻率，致死率過高反而會降低正向突變頻率。本研究中，我們選在致死率為75%時的劑量作為誘變劑量，正向突變頻率達到24.3%，這也驗證了亞硝基胍低致死率下有較好的正向突變頻率，也說明亞硝基胍確實是良好的化學(xué)誘變劑。為了進一步改良菌種，鞏固化學(xué)誘變得到的優(yōu)良結(jié)果，我們又進行了紫外誘變。根據(jù)經(jīng)驗，紫外誘變在很高致死率下才有較好效果，所以我們選擇致死率達到95%時的劑量作為誘變條件進行研究。最終篩選得到含油率68%，DHA占總脂肪酸比例為57%的適用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株。

一直以來，菌種誘變后的篩選是一項極其耗費時間和精力的工作。對于不同的產(chǎn)物，很多研究者開發(fā)了如透明圈、變色圈、抑菌圈等快速篩選的方法。針對裂殖壺菌，很多研究者進行了許多方法的嘗試，朱路英等[11]先以生物量為首要因素進行初篩，再以含油率高作為指標進行復(fù)篩，最后得到高DHA含量菌株；而張麗等[12]使用超氧化物歧化酶、丙二醛、脯氨酸作為裂殖壺菌菌種性能評價的新指標進行篩選。以上方法無法同時兼顧含油率和DHA含量兩個指標，存在漏選優(yōu)良性狀菌株的可能。本研究采用了蘭君等[4]開發(fā)的核磁共振原位檢測胞內(nèi)油脂含量和DHA含量，兼顧兩者，不漏選優(yōu)良菌株。但是，核磁共振法也存在干擾因素較多，對儀器設(shè)備要求較高和對研究者要求高的缺點。在今后的研究中，干擾因素的去除和靈敏度的提高將會是重點。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Screening of high DHA yield strains from Aurantiochytrium sp.by using intracellular NMR method

LI Yueming,XU Jianchun,SUN Huibin,YU Shuijian,LI Xia
（Qingdao Langyatai（Group）Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China）

Aurantiochytrium sp.was mutated by the combination of nitrosoguanidine and UV radiation.The intracellular lipid content and DHA proportion in total fatty acid of three hundred mutants were detected by means of a rapid in situ NMR method,and 10 mutants were selected considering these two indicators.Finally,one high DHA yield mutant was characterized through further characterization of its other properties.Compared with the wild strain,the mutant has equivalent biomass but 1.17 and 1.14 times of lipid contents and DHA proportion,which reached 68%of dry cell weight and 57%of total fatty acids respectively.This mutant was designated as Aurantiochytrium sp.KYX-01,which is very suitable for the industrial production of DHA oil because of its excellent properties.

Aurantiochytrium;intracellular Nuclear Magnetic Resonance;mutation breeding;docosahexaenoic acid（DHA）

TQ64

A

1674-2214（2015）02-0020-04

2014-12-16

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2014AA021701）

李悅明（1964—），男，高級工程師，主要從事有機酸發(fā)酵工程研發(fā)、工程項目設(shè)計等方面的研究，E-mail:xjclyt@126.com.