李琴，鄢洪德，鄭建永，汪釗

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 3 1 0 0 1 4）

無(wú)溶劑體系脂肪酶Lipozyme TL IM催化拆分DL-薄荷醇

李琴，鄢洪德，鄭建永，汪釗

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 3 1 0 0 1 4）

為提高非水相脂肪酶法拆分DL-薄荷醇反應(yīng)的底物濃度，建立了以乙酸乙烯酯為?；w的無(wú)溶劑體系。實(shí)驗(yàn)考察了底物濃度、酶量、溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)脂肪酶Lipozyme TL IM動(dòng)力學(xué)拆分DL-薄荷醇的影響，得到最佳反應(yīng)條件為DL-薄荷醇濃度2.8mol/L，酶用量0.5 g，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間6 h。此條件下，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為22.7%，e.e.p為99.1%。脂肪酶Lipozyme TL IM重復(fù)利用20次，酶立體選擇性基本不變，相對(duì)酶活為38.7%。

Lipozyme TL IM；DL-薄荷醇；拆分；無(wú)溶劑體系

薄荷醇有8個(gè)立體異構(gòu)體，只有L-薄荷醇具有殺菌止癢、興奮鎮(zhèn)痛、助消化、促滲透等功效，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、茶類(lèi)和煙草產(chǎn)品等眾多領(lǐng)域［1］。全球范圍內(nèi)所消耗的L-薄荷醇70%來(lái)源于天然薄荷精油，但由于日照、天氣的影響，從天然薄荷葉中提取得到的L-薄荷醇無(wú)法滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求?，F(xiàn)今，因生物催化法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)消耗能量少、成本低、效率高、拆分效果好等優(yōu)點(diǎn)，慢慢取代一些化學(xué)合成法成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向［2-3］。

目前，關(guān)于有機(jī)相中酶催化拆分DL-薄荷醇的研究報(bào)道有很多，但大多數(shù)生物催化劑的活力較低、選擇性不高、制備成本較高。其中，效果較好的是Othman等［4］報(bào)道的以固定在活性環(huán)氧材料上的褶皺假絲酵母脂肪酶為催化劑，以丁酸酐為酰基供體來(lái)拆分DL-薄荷醇。結(jié)果表明該固定化酶的活性、立體選擇性和穩(wěn)定性都很好，但實(shí)驗(yàn)成本較高且底物濃度較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

與有溶劑體系相比較，無(wú)溶劑酶催化體系在催化效率、產(chǎn)物提取以及過(guò)程綠色化等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)［5］。但是，目前基于無(wú)溶劑體系的酶動(dòng)力學(xué)拆分DL-薄荷醇的研究相對(duì)較少。Shimada等［6］在無(wú)溶劑體系中利用褶皺假絲酵母脂肪酶催化DL-薄荷醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)，雖然提高了底物濃度，但拆分效果不夠理想。為了在高底物濃度下高效率、高選擇性地催化拆分DL-薄荷醇，本實(shí)驗(yàn)在無(wú)溶劑體系中進(jìn)行，以成本相對(duì)較低的脂肪酶Lipozyme TL IM作為催化劑，通過(guò)對(duì)反應(yīng)過(guò)程中各種條件的優(yōu)化，得到光學(xué)純的L-乙酸薄荷酯。

1 材料和方法

1.1 主要材料

脂肪酶Lipozyme TL IM（Thermomyces lanuginosus lipase固定在二氧化硅上），丹麥諾維信公司；DL-薄荷醇，阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；其他材料均購(gòu)于阿拉丁試劑（上海）有限公司。所有試劑在使用前用4A分子篩除水24 h以上，密封保存。

1.2 氣相色譜檢測(cè)方法

采用GC-2010 plus氣相色譜儀（日本島津公司）檢測(cè)反應(yīng)液中各物質(zhì)的光學(xué)純度。手性柱為CP-Chirasil-Dex CB石英毛細(xì)管柱（25m×0.25mm× 0.25μm），F(xiàn)ID檢測(cè)器；檢測(cè)條件：柱溫為120℃，恒溫保持13min，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度250℃，載氣為高純氮?dú)?，柱頭壓101.7 kPa，線速度35 cm/sec，尾吹3.0 mL/min，分流比100∶1。由氣相色譜儀測(cè)定出的各物質(zhì)的峰面積計(jì)算。產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值（e.e.p）、底物的對(duì)映體過(guò)量值（e.e.s）和轉(zhuǎn)化率（C），計(jì)算公式如下：式中：P-和P+分別表示氣相檢測(cè)結(jié)果中產(chǎn)物L(fēng)-乙酸薄荷酯和D-乙酸薄荷酯的峰面積；S-和S+分別表示氣相檢測(cè)結(jié)果中底物L(fēng)-薄荷醇和D-薄荷醇的峰面積。

1.3 DL-薄荷醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)體系

如無(wú)特別說(shuō)明，均采用以下反應(yīng)體系：在50 mL三角瓶中分別加入0.78 g（0.005 mol）DL-薄荷醇，1.8 g分子篩，一定量的酰基供體和脂肪酶Lipozyme TL IM，30℃，200 r/min水浴搖床上反應(yīng)一段時(shí)間后，取一定量的反應(yīng)液（必要時(shí)進(jìn)行稀釋?zhuān)?，離心除去酶和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，時(shí)間7min，進(jìn)行氣相檢測(cè)。

1.4 脂肪酶LipozymeTLIN的穩(wěn)定性

當(dāng)反應(yīng)一段時(shí)間后，終止反應(yīng)。通過(guò)過(guò)濾除去反應(yīng)液，得到的酶用3 mL甲基叔丁基醚洗滌3次以除去酶表面殘存的物質(zhì)。然后置于室溫下，使其表面的溶劑揮發(fā)，作為下一批反應(yīng)用酶。更換分子篩，在相同的條件下反應(yīng)同樣時(shí)間，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。以相同的方法重復(fù)數(shù)次上述操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；w的影響

在醇類(lèi)物質(zhì)確定的前提下，無(wú)溶劑反應(yīng)體系相比有溶劑反應(yīng)體系，?；w的種類(lèi)對(duì)脂肪酶催化拆分效果的影響更為顯著，所以，首先對(duì)其進(jìn)行考察。為避免水的產(chǎn)生對(duì)反應(yīng)平衡和酶活的影響，通常選擇酯或酸酐作為酰基供體。結(jié)果如表1，討論了實(shí)驗(yàn)中加入不同酰基供體對(duì)酶活和立體選擇性的影響。

表1 不同?；w對(duì)反應(yīng)的影響

由表1可知，乙酸乙烯酯作為酰基供體時(shí)，反應(yīng)速率最大，酶的選擇性最好。乙酸酐作為?；w時(shí)，反應(yīng)速率僅次于乙酸乙烯酯，但e.e.p為0，酶對(duì)底物的兩種構(gòu)型沒(méi)有表現(xiàn)出選擇性，并且，在反應(yīng)過(guò)程中乙酸酐水解產(chǎn)生大量乙酸導(dǎo)致酶微環(huán)境pH值下降，從而影響酶的活性和選擇性。因此，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙烯酯作為酰基供體。

2.2 DL-薄荷醇濃度的影響

無(wú)溶劑反應(yīng)體系中，底物同時(shí)起到反應(yīng)溶劑的作用，因此，底物濃度對(duì)反應(yīng)影響很大。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)改變乙酸乙烯酯的量來(lái)改變DL-薄荷醇的濃度?？疾炝说孜餄舛葹?.09、1.37、1.84、2.8、3.75、4.5 mol/L對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 不同底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響

上述結(jié)果表明，建立的無(wú)溶劑體系可以作為拆分DL-薄荷醇的反應(yīng)體系。脂肪酶Lipozyme TL IM對(duì)DL-薄荷醇具有明顯的對(duì)映體選擇性，它優(yōu)先利用L-薄荷醇與乙酸乙烯酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，即優(yōu)先生成L-乙酸薄荷酯。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的增加而增加，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.8 mol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大；超過(guò)2.8mol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率明顯下降。底物濃度對(duì)產(chǎn)物e.e.p影響不大，不同底物濃度下的e.e.p都大于98%。因此，最適底物濃度為2.8mol/L，此時(shí)摩爾比（乙酸乙烯酯∶DL-薄荷醇）為2.0，轉(zhuǎn)化率為40.5%，e.e.p為98.6%，這說(shuō)明脂肪酶Lipozyme TL IM在高底物濃度下仍能保持較高的活性和立體選擇性。

2.3 酶量的影響

對(duì)于一個(gè)酶催化的反應(yīng)來(lái)說(shuō)，酶用量有一個(gè)最大值，此時(shí)酶已達(dá)到最大反應(yīng)速率，再增加酶用量，一方面底物不足，另一方面酶量過(guò)多會(huì)使酶分子之間的空間位阻增大，不利于活性中心的有效位點(diǎn)和底物的結(jié)合，同時(shí)也造成酶的浪費(fèi)。如圖2，實(shí)驗(yàn)中討論酶量為0.2～2.0 g對(duì)反應(yīng)的影響。

圖2 不同酶量對(duì)反應(yīng)的影響

由圖2可知，當(dāng)體系中加入0.5 g酶時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大43.39%，繼續(xù)增加酶量，反應(yīng)趨于平衡，這可能是由于過(guò)多的酶制劑容易增加反應(yīng)底物的傳質(zhì)阻力，不利于反應(yīng)的正常進(jìn)行。另外，隨著酶量的增加，由于兩種構(gòu)型底物的催化反應(yīng)速度都得到一定程度的提高，底物的e.e.p減小。因此，選擇0.5 g作為最適酶量。

2.4 溫度的影響

酶的活性受溫度影響較大，低溫可能使酶活性較低不能進(jìn)行催化反應(yīng)或反應(yīng)速度較慢，過(guò)高的溫度可能導(dǎo)致酶的變性而失去活性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)溫度梯度來(lái)考察溫度對(duì)無(wú)溶劑體系中轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同溫度對(duì)反應(yīng)的影響

由圖3可知，反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增大，在60℃的高溫條件下，脂肪酶Lipozyme TL IM依然保持了較高的活性，這是由于一方面高溫下反應(yīng)產(chǎn)生的乙醛大量揮發(fā)，減小了其對(duì)酶活的影響；另一方面較高的反應(yīng)溫度會(huì)減小無(wú)溶劑體系的傳質(zhì)黏度，加快底物分子熱運(yùn)動(dòng)的速度。當(dāng)溫度從25℃升高到30℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率從29.4%增加到34.2%，增加明顯。e.e.p隨著溫度的升高而降低，溫度從30℃升高到60℃，e.e.p從98.8%降低到96%，降低明顯。從綠色經(jīng)濟(jì)的角度考慮，該反應(yīng)的最適溫度定為30℃。

2.5 反應(yīng)時(shí)間曲線

從圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率增加緩慢，產(chǎn)物e.e.p逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)6 h，e.e.p低于99%。并且，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)生的乙醛量越多，對(duì)酶的負(fù)影響越大，這是由于乙醛會(huì)與酶蛋白分子中的Lys殘基的氨基形成schiff堿，可能使酶失活。為了高效率、高選擇性的拆分DL-薄荷醇，選擇最適的反應(yīng)時(shí)間為6 h，此時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為22.7%，e.e.p為99.1%。

圖4 反應(yīng)時(shí)間曲線

2.6 脂肪酶LipozymeTLIN的穩(wěn)定性

當(dāng)每一批反應(yīng)結(jié)束后，脂肪酶Lipozyme TL IM經(jīng)甲基叔丁基醚洗滌3次以除去酶表面的殘存物，置于室溫下風(fēng)干后加入到新的反應(yīng)液中重復(fù)利用以考察脂肪酶的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 脂肪酶Lipozym e TL IN的穩(wěn)定性

酶重復(fù)利用20次得到如圖5的結(jié)果。酶重復(fù)利用3次，轉(zhuǎn)化率有略微增加，這可能是酶更好適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果；重復(fù)利用5次，轉(zhuǎn)化率由34.2%降低到27.1%；當(dāng)酶重復(fù)利用20次后，酶仍未完全失活，相對(duì)酶活為38.7%，且酶的選擇性基本保持不變。這表明脂肪酶Lipozyme TL IM在該反應(yīng)體系中具有良好的穩(wěn)定性。良好的酶重復(fù)利用情況可以大大降低酶催化反應(yīng)的成本，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。

3 結(jié)論

在無(wú)溶劑體系中乙酸乙烯酯既作為?；w也作溶劑，脂肪酶Lipozyme TL IM作為生物催化劑表現(xiàn)出較高的底物耐受性和穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)底物濃度、酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化得到最適反應(yīng)條件：DL-薄荷醇濃度2.8 mol/L，酶0.5 g，30℃反應(yīng)6 h，轉(zhuǎn)化率為22.7%，e.e.p為99.1%。該酶在無(wú)溶劑體系中的穩(wěn)定性較好，重復(fù)利用20次，酶的選擇性基本保持不變，相對(duì)酶活為38.7%。從整個(gè)無(wú)溶劑體系中脂肪酶Lipozyme TL IM催化乙酸乙烯酯和DL-薄荷醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)果可以看出，反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)便易行、反應(yīng)速度快、拆分效果好，且反應(yīng)中不加溶劑，既降低了生產(chǎn)成本，也不用考慮溶劑對(duì)酶活的影響。

［1］ETZOLD B，JESS A，NOBIS M.Epimerisation of menthol stereoisomers：Kinetic studies of the heterogeneously cat alysed menthol production［J］.Catalysis Today，2009，140(1/2)：30-36.

［2］李云霞，李瓊.薄荷醇手性拆分的研究進(jìn)展［J］.香料香精化妝品，2009(1)：40-44.

［3］SHU Bai，ZHENG Guo，WEILiu，et，al.Resolution of(+/-)-menthol by immobilized Candida rugosa lipase on superparamagnetic nanoparticles［J］.Food Chemistry，2006，96(1)：1-7.

［4］OTHMAN SS，BASRIM，HUSSEIN M Z，et al.Production of highly enantioselective(-)-menthyl butyrate using Candida rugosa lipase immobilized on epoxy-activated supports［J］.Food Chemistry，2008，106(2)：437-443.

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Lipozyme TL IM catalyzed resolution of DL-menthol in solvent-free system

LIQin，YAN Hongde，ZHENG Jianyong，WANG Zhao
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

In order to enhance the substrate concentration of lipase catalyzed resolution of DL-menthol in non-aqueous phase，a solvent-free system was established using vinyl acetate as acyl donor.The effects of substrate concentration，enzyme dosage，temperature and reaction time on kinetic resolution of DL-menthol were investigated.The optimum conditions were determined as follows：substrate concentration 2.8 mol/L，enzyme dosage 0.5 g，reaction temperature 30℃，reaction time 6 h.Under above conditions，the conversion reached 22.7%with e.e.pvalue of 99.1%. In addition，the lipase reserved 38.7%of its activity with stable enantioselectivity after 20 recycles

Lipozyme TL IM；DL-menthol；resolution；solvent-free system

O621

A

1674-2214(2015)04-0015-04

2015-05-11

李琴（1989—），女，湖北荊州人，碩士，主要從事DL-薄荷醇催化拆分方面的研究，E-mail：435984107@qq.com.

汪釗教授，E-mail：hzwangzhao@163.com.