廖承軍，鄭微，黃建峰，劉成龍，柳志強(qiáng)，程新平，毛寶軍，陳德水

（1.浙江華康藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 324302；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

葡萄糖異構(gòu)酶基因的篩選、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

廖承軍1，鄭微2，黃建峰2，劉成龍2，柳志強(qiáng)2，程新平1，毛寶軍1，陳德水1

（1.浙江華康藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 324302；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

通過基因挖掘的方法從NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選得到一株嗜熱的葡萄糖異構(gòu)酶（GI）產(chǎn)生菌株Thermotoga petrophila RKU-1，化學(xué)合成該酶的基因并在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行可溶性表達(dá)。重組葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)過Ni-NTA柱親和層析分離純化后，對(duì)純酶進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示為單一條帶，其分子量大小為50.8 kDa。測(cè)定了該重組酶對(duì)底物D-葡萄糖的活力為19.8 U/mg，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。該酶最適溫度和pH分別為85℃和7.0，Co2+對(duì)催化活力起著非常重要的作用，對(duì)底物D-葡萄糖的Km值和Vmax值分別為373 mmol/L和13.4 U/mg。在最適條件下，反應(yīng)在4 h內(nèi)達(dá)到平衡，果糖得率最高達(dá)到53.8%。

基因挖掘；葡萄糖異構(gòu)酶；表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)

引言

葡萄糖異構(gòu)酶（glucose isomerase，EC 5.3.1.5）又稱木糖異構(gòu)酶（xylose isomerase），在體內(nèi)催化D-木糖生成D-木酮糖，在體外催化D-葡萄糖生成D-果糖［1］。因此，該酶被廣泛用于高果糖漿（HFCS）的工業(yè)生產(chǎn)中［2-3］。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)的HFCS均為42%HFCS，而55%HFCS因其口感和甜度等性能擁有最大的市場(chǎng)需求［4-5］。要得到55%HFCS，需要經(jīng)歷下游色譜純化和濃縮等步驟［6］。研究報(bào)道顯示，葡萄糖和果糖之間的異構(gòu)化反應(yīng)存在著熱動(dòng)力學(xué)平衡，隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率也逐漸升高，當(dāng)溫度大于等于85℃時(shí)，理論轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到55%以上［7-8］。因此，篩選構(gòu)建一株高活力且耐高溫的葡萄糖異構(gòu)酶，已成為實(shí)現(xiàn)一步法生產(chǎn)55%HFCS的迫切需求。

目前，基因挖掘作為一種快速、高效、便捷的篩選生物酶催化劑的新型手段，已經(jīng)越來越廣泛地被使用并代替?zhèn)鹘y(tǒng)的土樣篩選［9］。

本課題組通過基因挖掘的方法從NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選得到一株嗜熱的葡萄糖異構(gòu)酶（GI）產(chǎn)生菌株Thermotoga petrophila RKU-1，化學(xué)合成該酶的基因并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)。利用親和層析實(shí)現(xiàn)了重組葡萄糖異構(gòu)酶TPGI的分離純化，并從最適反應(yīng)溫度、最適pH、最適金屬離子及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等方面研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

宿主大腸桿菌（E.coli BL21（DE3））為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，表達(dá)載體pET-28b(+)購自Takara公司。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶Nde I和Eco RI、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP購自上海申能博彩公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自Promega公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司；D-葡萄糖購自阿拉丁試劑有限公司；D-果糖購自Solarbio公司。除特別注明的試劑外，其他各種實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物

根據(jù)TPGI基因序列，設(shè)計(jì)引物（含限制性酶切位點(diǎn)）上游引物：5＇-CATGCCATGGTAAT GGAATTTTTCCCTG-3＇，(Nco I)，下游引物：5＇-CCGCTCGAGACGAAGTTCAGCGATTG-3＇，(Xho I)，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0，接種之前加入50μg/mL卡那霉素；固體LB培養(yǎng)基添加1.5%～2.0%瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)?？敲顾乜股刭A存液的配制：用無菌水配制50mg/mL的抗生素母液，過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)終濃度為50μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因挖掘方法篩選葡萄糖異構(gòu)酶

以最嗜熱的Thermotogamaritime來源和催化活力較高的商業(yè)化的Streptomycesmurinus來源的葡萄糖異構(gòu)酶（TMGI、SMGI）氨基酸序列為模板，從NCBI數(shù)據(jù)庫中（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi），通過Blast X和Blast P比對(duì)搜索，最終選擇了一株與上述TMGI、SMGI同源性分別為98%、31%，且無研究報(bào)道的嗜熱Thermotoga petrophila RKU-1來源的葡萄糖異構(gòu)酶。

1.2.2 葡萄糖異構(gòu)酶基因的密碼子優(yōu)化及其合成

選取的葡萄糖異構(gòu)酶基因通過軟件Codon Adaptation Tool，以E.coli BL21（DE3）的密碼子偏好性為基準(zhǔn)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.2.3 重組葡萄糖異構(gòu)酶的構(gòu)建

以合成的含有目的基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增葡萄糖異構(gòu)酶基因，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱變性5min，30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2min），72℃延伸10min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析并回收，回收后的PCR產(chǎn)物純化后與表達(dá)載體pET-28b (+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證為陽性克隆子的菌，送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，通過DNAMAN軟件分析測(cè)序序列是否為目的序列。

1.2.4 重組葡萄糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS

PAGE分析

制備種子液：用接種環(huán)從斜面上挑取鑒定正確的菌種，接種至50mL LB種子液培養(yǎng)基搖瓶（含50μg/mL Kan），37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，一般培養(yǎng)時(shí)間10～12 h。制備發(fā)酵液：將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%（V/ V），37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)菌體濃度至OD600為0.6～0.8時(shí)，添加濃度為0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28℃、150 r/min誘導(dǎo)12 h后離心收集菌體。粗酶液的制備：將離心收集到的菌體用純水溶解后進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎液于4℃下12 000 r/ min離心20min，取上清獲得粗酶液。純酶液的制備：將粗酶液過Ni-NTA柱分離純化獲得純酶液。最終得到的純酶液通過SDS-PAGE分析純化結(jié)果并測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 重組葡萄糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

以D-葡萄糖為底物，利用高效液相色譜測(cè)定葡萄糖異構(gòu)酶的活性。反應(yīng)體系如下：在50 mmol/ L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）與一定量酶液的10 mL反應(yīng)體系中，加入底物100 mg/mLD-葡萄糖，激活劑1mmol/LCo2+，10mmol/LMg2+。85℃、150 r/min反應(yīng)10 min，冰浴3 min終止反應(yīng)。

通過測(cè)定不同溫度（55～100℃）下TPGI的酶活確定最適溫度；通過測(cè)定不同pH緩沖液中TPGI的酶活確定最適pH，緩沖液體系分別為：HAc/NaAc（pH 4.0～6.0），PBS（pH 5.5～7.0），Tris/ HCl（pH 7.0～9.0），Gly/NaOH（8.5～10.0）；通過測(cè)定80、85、90℃下保溫一定時(shí)間后的殘余酶活確定酶的熱穩(wěn)定性；分別考察添加5mmol/L不同二價(jià)金屬離子（Mg2+，Mn2+，Co2+，Zn2+，Cu2+，Ba2+，Ni2+，F(xiàn)e2+，Ca2+）對(duì)酶活的影響；在底物D-葡萄糖濃度為37.5～300mmol/L范圍內(nèi)測(cè)定酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)。

測(cè)定催化進(jìn)程曲線，葡萄糖濃度10%（W/V），在最適溫度、pH以及最佳金屬離子濃度下反應(yīng)不同時(shí)間（0.5～10 h），取樣測(cè)定果糖得率。

HPLC檢測(cè)產(chǎn)物D-果糖條件如下：色譜柱為Hi-Plex Ca柱（300 mm×7.7 mm），柱溫為80℃，流動(dòng)相為超純水，流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。在該條件下，D-葡萄糖的保留時(shí)間為15.7min，D-果糖的保留時(shí)間為20.2min。

葡萄糖異構(gòu)酶酶活單位（U）定義為：在85℃、pH 7.0條件下，每分鐘生成1μmol D-果糖所需的酶量定義為1 U。比酶活定義為：每毫克蛋白中所含的酶活單位，用U/mg表示。果糖得率定義為：異構(gòu)化轉(zhuǎn)化生成的D-果糖和初始底物D-葡萄糖的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組葡萄糖異構(gòu)酶的表達(dá)及純化

合成的葡萄糖異構(gòu)酶基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，連接于表達(dá)載體pET-28b(+)，重組質(zhì)粒pET-28b(+) -TPGI轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21（DE3），挑取單菌落培養(yǎng)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組葡萄糖異構(gòu)酶TPGI以可溶蛋白的形式表達(dá)，將其通過Ni-NTA柱分離純化后，SDS-PAGE檢測(cè)到單一條帶，達(dá)到電泳純水平，如圖1所示。該重組葡萄糖異構(gòu)酶TPGI的分子量約為50.8 kDa，與預(yù)期相符。經(jīng)過蛋白濃度和酶活力測(cè)定，計(jì)算得到TPGI的比酶活為19.8 U/mg。

圖1 重組葡萄糖異構(gòu)酶TPG I的SDS-PAGE分析M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1—TPGI未經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)；2—TPGI經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)；3—TPGI經(jīng)過Ni-NTA柱分離純化

2.2 葡萄糖異構(gòu)酶突變體催化生產(chǎn)HFCS的條件優(yōu)化

2.2.1 最適溫度和最適pH

不同溫度下的酶活力測(cè)得結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，TPGI最適催化溫度為85℃，在低于55℃時(shí)，TPGI幾乎無催化活力；70℃以下，其酶活力也相對(duì)較低；溫度達(dá)到100℃時(shí)，TPGI的酶活力仍較高，顯示出較好的嗜熱性能。不同pH下酶活力結(jié)果分析如圖3所示，TPGI的最適催化pH為7.0（Tris-HCl緩沖液），其在酸性條件下，酶活損失較大。

圖2 溫度對(duì)重組葡萄糖異構(gòu)酶活力的影響

圖3 pH對(duì)重組葡萄糖異構(gòu)酶活力的影響

2.2.2 熱穩(wěn)定性

以0小時(shí)即未保溫時(shí)的酶活力定義為100%，其他保溫不同時(shí)間的酶活力與其對(duì)比求取相對(duì)酶活力，不同溫度下保溫不同時(shí)間，求得的酶活力結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，隨著溫度的升高，TPGI的熱穩(wěn)定性有所下降，在80℃時(shí)，其半衰期為9 h，在最適溫度85℃時(shí)，1 h后其酶活力是初始的80%。

圖4 重組葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性

2.2.3 不同二價(jià)金屬離子對(duì)酶活的影響

葡萄糖異構(gòu)酶是金屬酶，在催化異構(gòu)化的過程中，需要金屬離子的輔助催化，而且不同金屬離子對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的活力和穩(wěn)定性起著非常重要的作用。目前所報(bào)道的大多數(shù)葡萄糖異構(gòu)酶主要以Mg2+、Mn2+、Co2+或者以其中兩種金屬離子作為助催化劑［10］。以最高的酶活力設(shè)為100%，其他金屬離子對(duì)酶活力影響與最高酶活力對(duì)比，其結(jié)果如圖5所示。圖中N對(duì)應(yīng)的是未加任何金屬離子，幾乎無任何催化活力，表明TPGI在高溫催化下，需要金屬離子才能維持其催化活力；Co2+對(duì)TPGI的催化活力起著非常重要作用，Zn2+、Cu2+、Ni2+對(duì)酶的催化不起作用，其活力幾乎為零；Mg2+、Mn2+在TPGI的催化當(dāng)中起到輔助作用，Ba2+、Ni2+、Fe2+、Ca2+單獨(dú)存在對(duì)酶催化起著微弱作用。

圖5 金屬離子對(duì)重組葡萄糖異構(gòu)酶活力的影響

2.2.4 酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)速度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行雙倒數(shù)曲線擬合作圖（圖6）。曲線擬合度R2=0.99395，擬合方程為y=27.95786x+ 74.91392。根據(jù)擬合曲線計(jì)算得到Km和Vmax分別為373mmol/L和13.4 U/mg。

圖6 重組葡萄糖異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.5重組葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖反應(yīng)進(jìn)程

重組葡萄糖異構(gòu)酶TPGI催化葡萄糖生成高果糖漿的反應(yīng)進(jìn)程研究表明（圖7），果糖得率隨著時(shí)間的增加快速上升，反應(yīng)1 h，果糖得率就能達(dá)到42%，2 h得率能夠達(dá)到50%，且在4 h達(dá)到最大值53.8%，之后反應(yīng)達(dá)到平衡，得率趨于穩(wěn)定。

圖7 重組葡萄糖異構(gòu)酶的催化葡萄糖的反應(yīng)進(jìn)程

3 結(jié)論

本文通過基因挖掘的方法從NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選得到一株嗜熱的葡萄糖異構(gòu)酶（GI）產(chǎn)生菌株Thermotoga petrophila RKU-1，化學(xué)合成該酶的基因并在宿主大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行可溶性表達(dá)。重組葡萄糖異構(gòu)酶TPGI經(jīng)過Ni-NTA柱親和層析分離純化后，對(duì)純酶進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示為單一條帶，其分子量大小為50.8 kDa。測(cè)定了該重組酶對(duì)底物D-葡萄糖的活力為19.8 U/mg，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。確定了該酶的最適溫度和pH分別為85℃和7.0，與之前一些文獻(xiàn)報(bào)道的葡萄糖異構(gòu)酶相比，擁有較高的催化最適溫度和不依賴堿性條件催化［11-12］。金屬離子中Co2+對(duì)該酶的催化活力起著非常重要的作用，對(duì)底物D-葡萄糖的Km值和Vmax值分別為373mmol/L和13.4 U/mg。在最適條件下，反應(yīng)在4 h內(nèi)達(dá)到平衡，果糖得率最高達(dá)到53.8%。后續(xù)可通過計(jì)算機(jī)軟件模擬和分子改造技術(shù)進(jìn)一步改變?cè)摰鞍椎奶匦?，提高與底物的親和力和催化效率，并尋找一種合適的固定化方法穩(wěn)定酶的使用率，將使工業(yè)化大規(guī)模一步酶法生產(chǎn)55%HFCS成為可能。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Genomem ining，expression and characterization of a hyperthermophilic glucose isom erase from Thermotoga petrophila RKU-1

LIAO Chengjun1，ZHENGWei2，HUANG Jianfeng2，LIU Chenglong2，LIU Zhiqiang2，CHENG Xinping1，MAO Baojun1，CHEN Deshui1
(1.Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Quzhou 324302，China；2.Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

A hyperthermophilic glucose isomerase from Thermotoga petrophila RKU-1(TPGI)was screened by genomemining from NCBIdatabase.The gene of TPGIwas synthesized and expressed as a soluble protein in E.coli BL21(DE3).The recombinant enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography.The SDS-PAGE analysis of the purified TPGI revealed a single band with a molecular weight of around 50.8 kDa.The specific activity of the recombinant TPGI to D-glucose was 19.8 U/mg.The enzyme exhibited itsmaximum activity at 85℃，pH 7.0 and showed significant dependence on Co2+.The Kmand Vmaxto substrate D-glucosewere 373 mmol/L and 13.4 U/ mg，respectively.The yield of D-fructose reached 53.8%and the isomerization graduallymaintained equilibrium after 4 h under the optimum conditions.

genomemining；glucose isomerase；expression；enzymatic properties

Q814

A

1674-2214(2015)04-0019-05

2015-05-28

國家自然科學(xué)基金（31401527）；浙江省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013C02027）

廖承軍（1976—），男，浙江開化人，工程師，主要從事功能性糖和糖醇生產(chǎn)工藝技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用，E-mail：liaochengjun@huakangpharma.com.