詹業(yè)奇

(江西國(guó)藥有限責(zé)任公司，江西 南昌 330052)

MHP-2b免疫活性的研究

詹業(yè)奇

(江西國(guó)藥有限責(zé)任公司，江西 南昌 330052)

目的：研究蝙蝠蛾被孢霉多糖(MortierellahepialiPolysaccharides，MHP)其中一個(gè)組分MHP-2b的免疫活性。方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：給MHP-2b組小鼠外周的白細(xì)胞，紅細(xì)胞，血小板數(shù)量和骨髓DNA含量有增加(*P0.01，*P0.05，與空白組比較；P0.01，P0.05，與模型組比較)，隨劑量增加增幅越大。結(jié)論：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：MHP-2b能夠明顯的減輕環(huán)磷酰胺帶來的骨髓抑制作用。

蝙蝠蛾被孢霉多糖MHP-2b白細(xì)胞 抗腫瘤 環(huán)磷酰胺

前言

多糖是生物高分子家族組成中的最豐富多彩的成員，它是由單糖多聚而成的天然高分子化合物，已知的天然多糖約有300多種，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物組織中。近10年來，隨著天然藥物化學(xué)、藥理學(xué)研究的不斷深入及分析手段突飛猛進(jìn)的發(fā)展，多糖僅作為支持組織和能量來源的傳統(tǒng)觀念已被突破[1]。近年來，大量藥理及臨床研究表明，多糖類藥物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，其免疫療法給近代腫瘤、艾滋病及其他疾病的治療開辟了新的方向，因此多糖的研究引起了國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的極大興趣。

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)從蟲草發(fā)酵菌絲體中提取的活性多糖的免疫活性方面進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步將其開發(fā)為各種免疫調(diào)節(jié)劑開辟了道路，也為其后續(xù)研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)的工藝基礎(chǔ)。

1 MHP-2b的免疫活性研究

大劑量應(yīng)用環(huán)磷酰胺給小鼠腹腔注射，使其與小鼠組織細(xì)胞中功能基團(tuán)如DNA、蛋白質(zhì)分子中氨基、巰基、羥基等作用，發(fā)生烷化作用，造成小鼠骨髓造血機(jī)能抑制和外周血白細(xì)胞數(shù)，血小板減少。實(shí)驗(yàn)證明MHP-2b能夠明顯的減輕環(huán)磷酰胺帶來的骨髓抑制作用，增加小鼠外周的白細(xì)胞，紅細(xì)胞和血小板數(shù)量。起到輔助抗腫瘤藥物治療的效果。

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康ICR小鼠，體重20g左右，共62只，雌雄各半。普通級(jí)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

蟲草被孢菌粉，長(zhǎng)興制藥有限公司；

升白安，江蘇信孚藥業(yè)有限公司；

環(huán)磷酰胺(cytoxan)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.3 儀器

320-S型pH計(jì)，METTLERTOLEDO公司；

電子天平BS200S，北京賽利斯天平有限公司；

752紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密儀器廠；

LXJ2I型離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；

RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；

DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

三用電熱恒溫水箱，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；

漩渦混合器，浙江東城電器廠。

1.1.4 試劑

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸，南京化學(xué)試劑公司，分析純。

1.2 方法

1.2.1MHP-2b的提取方法

取一定量蟲草被孢菌粉，加入10倍95%乙醇(0.45uM濾膜過濾)，回流2小時(shí)脫脂，60℃烘干。稱重后，加入一定量的蒸餾水，用2MNaOH調(diào)pH為8，高溫提取，低速離心得上清液，殘?jiān)僦貜?fù)加水提取兩次，合并三次提取的上清液，用鹽酸將溶液pH調(diào)至中性，減壓濃縮至原體積的1/3，邊攪拌邊加入乙醇進(jìn)行沉淀，邊攪拌邊加入乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀(分級(jí)濃度分別為50%、65%、75%、85%)，靜置8h，8000rpm×10min高速離心，將所得沉淀依次95%乙醇，無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥。

1.2.2 血小板減少癥模型的建立

依據(jù)新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編介紹方法，分別用MHP-2b給藥的第三天同時(shí)小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，每日1次，連續(xù)3d；造骨髓抑制模型，同時(shí)給予治療藥物MHP-2b，以升百安為陽(yáng)性對(duì)照藥，其中以造模組停藥后3d左右下降至用藥前血小板計(jì)數(shù)的20%-30%為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

將小鼠隨即分為6組(每組10只)，分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、多糖(高、中、低)一共6組。按以下方式給藥：

(1)空白對(duì)照組：生理鹽水0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(2)環(huán)磷酰胺骨髓抑制模型組：生理鹽水0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(3)陽(yáng)性藥組：升百安按照正常人用劑量換算，25mg/kg，生理鹽水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(4)多糖(高劑量)組：20mg/kg，生理鹽水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(5)多糖(中劑量)組：10mg/kg，生理鹽水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1 次；

(6)多糖(低劑量)組：5mg/kg，生理鹽水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1 次。

除空白組，其余各組在給藥3天后按100mg/kg給藥，每日1次，連續(xù)3d。每隔4天測(cè)一次體重，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。給環(huán)磷酰胺7天后，眼眶取血，檢測(cè)血液生化指標(biāo)。

1.2.4 檢查指標(biāo)

(1)小鼠的一般狀況，造模成功的一般判定。

(2)停藥后第7天斷頭取血，進(jìn)行白細(xì)胞數(shù)及分類、紅細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)測(cè)定。

(3)骨髓DNA含量測(cè)定：取左側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用0.005MCaCl210ml將全部骨髓充入離心管中，置4℃冰箱30min，2500轉(zhuǎn)離心15min，棄上清，將沉淀物加0.2NHClO45ml充分混勻，90℃加熱15min，冷卻后過濾，取上清用紫外分光光度儀268nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸收A值。

(4)體重變化與脾臟指數(shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.3.1 對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)致外周血細(xì)胞減少的影響

結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可使小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)，紅細(xì)胞(RBC)和血紅蛋白(HB)明顯減少。MHP-2b5mg～20mg/kg范圍內(nèi)能夠顯著的增加環(huán)磷酰胺所致的WBC、RBC、HB的減少狀況，和模型組比較有顯著差異。

雌雄各半組別白細(xì)胞紅細(xì)胞血小板空白10.52±2.67.6±0.561622±215.2模型5.77±1.98**5.24±0.3**1252±361.1*陽(yáng)性9.2±2.29DD6.79±0.41D1493±327.3D多糖高9.74±2.09DD6.83±0.24D1599±232.2D多糖中8.25±1.85DD6.87±0.35D1447±227D多糖低7.37±2.19D6.9±0.7DD1293±321.6

注：**P<0.01，*P<0.05，與空白組比較；P<0.01，P<0.05，與模型組比較。

1.3.2 對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)致骨髓DNA和有核細(xì)胞減少的影響

結(jié)果表明CTX可使小鼠骨髓DNA含量和有核細(xì)胞數(shù)明顯減少，呈現(xiàn)明顯的骨髓抑制作用。MHP-2b能使減少的骨髓DNA含量和有核細(xì)胞數(shù)得以顯著回升，大劑量組療效優(yōu)于升白安片。

組別DNA含量有核細(xì)胞數(shù)空白1.107±0.177327.2±59.8模型0.621±0.091**167±41.2**陽(yáng)性0.8±0.091DD257.1±16.8DD多糖高0.887±0.131DD268.4±98.8DD多糖中0.712±0.141D206.1±42.3D多糖低0.656±0.177192.1±48.2D

注：**P<0.01，*P<0.05，與空白組比較；P<0.01，P<0.05，與模型組比較。

1.4 結(jié)論

環(huán)磷酰胺是臨床常用的治療腫瘤藥物，但其治療后引起一系列程度不同的副反應(yīng)，其中主要有骨髓抑制和免疫功能低下，造成白細(xì)胞，血小板減少癥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白細(xì)胞下降與骨髓造血功能衰退或障礙有直接關(guān)系。大劑量應(yīng)用環(huán)磷酰胺給小鼠腹腔注射，使其與小鼠組織細(xì)胞中功能基團(tuán)如DNA、蛋白質(zhì)分子中氨基、巰基、羥基等作用，發(fā)生烷化作用，造成小鼠骨髓造血機(jī)能抑制和外周血白細(xì)胞數(shù)，血小板減少[2]。

研究表明MHP-2b能升高模型小鼠的白細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)，增加小鼠體重，能夠?qū)弓h(huán)磷酰胺所致白細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)的降低；MHP-2b還可以增加骨髓DNA含量，說明其對(duì)環(huán)磷酰胺所致的骨髓抑制造血功能減退有治療作用，能夠促進(jìn)骨髓粒細(xì)胞增殖。以上說明MHP-2b對(duì)骨髓造血功能和外周血白細(xì)胞和血小板增殖具有促進(jìn)作用，增強(qiáng)免疫功能，從而對(duì)骨髓抑制的模型小鼠具有明顯治療作用。這為以后臨床推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)MHP-2b的升白和升血小板作用作了初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，所用動(dòng)物數(shù)量少，有關(guān)它的藥理活性篩選還有待進(jìn)一步探討。

2 綜述

蟲草多糖(Cordyceps.Polysacchride，CP)是冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有抗肝纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[3][4][5]、降血糖等多方面的作用。本文對(duì)CP的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能的藥理機(jī)制進(jìn)行綜述。

(1)藥理特性

其性平，味甘，入肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰之功效。多糖是冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗輻射作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和降血糖等多方面藥理作用，對(duì)人和動(dòng)物低毒無(wú)害，對(duì)治療腫瘤和感染所引起的免疫抑制有潛在價(jià)值。

(2)蟲草多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[6][7]

多糖是由許多單糖分子以糖苷鍵結(jié)合而成的天然高分子化合物，廣泛存在于高等植物、動(dòng)物細(xì)胞膜及微生物細(xì)胞壁中，是生命有機(jī)體不可缺少的組成部分并履行一系列不同的生理功能，其中真菌多糖因其獨(dú)特的低毒而免疫活性強(qiáng)的生物活性而引起人們廣泛的關(guān)注。在一般情況下，真菌多糖對(duì)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫，細(xì)胞免疫和體液免疫均有影響，但主要影響機(jī)體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、NK細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)以及RNA、DNA、蛋白質(zhì)的合成[8]，體內(nèi)cAMP與cGMP的含量，其結(jié)果是抗體生成，淋巴因子及干擾素的誘導(dǎo)生成增多[9]。作為一種生物非特異性免疫促進(jìn)劑，食藥用真菌多糖具有抗腫瘤、抗病毒、降血脂、影響免疫調(diào)節(jié)活性、延緩衰老、護(hù)肝排毒、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)生物合成等多種功效[10][11]。因此真菌多糖成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。

CPS(總多糖)對(duì)CDDP誘導(dǎo)的MDCK，Vero細(xì)胞損傷的細(xì)胞形態(tài)的影響[6][7][12]：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK，Vero細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以3.0×105/ml細(xì)胞濃度加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.16ml，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后，按如下方法加入藥物：CPS(總多糖)組加入20μl不同濃度的CPS(終濃度依次為12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)和20μl完全培養(yǎng)液，CDDP組加入20μl終濃度為2.5ug/ml的CDDP和20μl完全培養(yǎng)液，CPS+CDDP組加入20μl不同濃度的CPS(終濃度依次為12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)和20μl終濃度為2.5ug/ml的CDDP，空白對(duì)照組加40μl的完全培養(yǎng)液。放置培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞培養(yǎng)板置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

3 評(píng)價(jià)與展望

自1969年日本人發(fā)現(xiàn)一種具有抗腫瘤活性的真菌多糖而轟動(dòng)醫(yī)學(xué)界以來，全世界掀起了從真菌中尋找抗腫瘤成分的高潮[13]，冬蟲夏草多糖的各方面研究也從此展開。在臨床上可用于提高機(jī)體免疫功能，因而在抗腫瘤、抗感染和造血功能障礙等治療中發(fā)揮作用。由于野生冬蟲夏草的過度采集，同樣擁有增強(qiáng)免疫功能的蟲草被孢菌粉作為野生冬蟲夏草的替代品具有較大的市場(chǎng)。經(jīng)過更進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，必將為其新藥開發(fā)展現(xiàn)良好的前景[14]。

[1]于思明.蟲草腎茶膠囊對(duì)腎小球硬化模型大鼠ECM積聚與TIMP-1mRNA表達(dá)的影響[D].2008年，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué).

[2]于震等.地黃苷A對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠白細(xì)胞減少癥的影響[J].中草藥，2001，(11)：45-47.

[3]鄒建華，等.國(guó)外對(duì)多糖的抗腫瘤作用的研究簡(jiǎn)況[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，1991，13(6)：321-324.

[4]潘明繼.真菌多糖抗腫瘤研究的概況[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1985，5(2)：115-117.

[5]陳明.真菌多糖抗腫瘤研究的進(jìn)展[J].食用菌，1993，15(6)：41-42.

[6]呂江陵.紅細(xì)胞免疫與中醫(yī)藥研究[J].廣州醫(yī)藥，1994，(1)：4-5.

[7]張彩鳳，等.真菌多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器，2008，(10)：17-22.

[8]殷勤燕.靈芝抗腫瘤作用的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)食用菌，1996，15(4)：28.

[9]靖士俠，等.抗癌藥物及天然藥物有效成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1991，26(2)：72-76.

[10]林樹錢，等.我國(guó)藥用真菌的研究進(jìn)展(一)[J].中藥材，1987，1：44-46.

[11]林樹錢，等.我國(guó)藥用真菌的研究進(jìn)展(二)[J].中藥材，1987，2：37-39.

[12]呂小波.蟲草多糖對(duì)腎功能衰竭的治療及其作用機(jī)制研究[D].2008年，南京中醫(yī)藥大學(xué).

[13]唐茂芝，等.食用菌類食品作為功能性食品的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)[J].食品科技，1999，3：5-6.

[14]吳光昊，等.蛹蟲草多糖的分離及免疫活性的研究[J].中國(guó)天然藥物，2007，1：73-76.

The studieson immunity activities of MHP-2b

ZHAN Ye-qi

(JiangxiGuoyaopharmaceuticalCo.Ltd，JiangxiNanchang330052)

Object：The main purpose of this dissertation was to study immunity activities of MHP-2b which is a part of MHP.Method：In vivo studies：The number of leukocytes，red blood cells and platelets increased which were given MHP-2b.Conclusion：In vivo studies：MHP-2b can reduce the bone marrow inhibition caused by cyclophosphamide visible.

MHP MHP-2b WBC Antineoplastic Cyclophosphamidum