仇娟

摘要：隨著轉基因水稻研究在世界范圍內的研究和開發(fā)，以及轉基因水稻商業(yè)化的爭議性加劇，相關部門對糧食安全、食品安全更加關注，農業(yè)科研單位檢測轉基因水稻也將具有重要意義。參照農業(yè)部的質檢標準書和轉基因PCR檢測中的實踐經驗，對抗蟲轉基因水稻在轉基因檢測中可能出現(xiàn)的問題進行了技術層面和理論層面分析;同時對轉基因抗蟲水稻的啟動子、終止子、內參基因、靶基因等幾個元件的檢測分別進行探討，并重點分析了啟動子和終止子的檢測工作，根據(jù)研究者的工作經驗報道，從植物病毒學原理和植物基因工程的理論角度，提出了對轉基因PCR定性檢測中可能遇到問題的解決方案。

關鍵詞：轉基因水稻;定性檢測;啟動子;終止子;Bt基因;多重PCR;Real-time PCR

中圖分類號：Q78;S511 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0262-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.002

Problems and Strategies Qualitatively Detecting Genetically-modified Rice with Multiplex PCR and Real-time PCR

QIU Juan

（Food Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： As genetically-modified（GM） rice will be commercialized， qualitatively detecting GM rice becomes more and more important. Based authors practice in detecting of ?transgenic Bt ?rice with the quality standard of Chinese Ministry of Agriculture， the potential problems were analyzed from technical level and theoretical perspective. The detection of transgenic components （promoter， terminator， reference gene and target gene etc） of GM rice with PCR was discussed. The possible solutions were proposed from the principles of plant virology and genetic engineering based on previous reports.

Key words：genetically-modified（GM） rice;qualitative detection;promoter;terminator;Bt gene;multiplex PCR;real-time PCR

轉基因技術應用于作物以來，轉基因產品如玉米、大豆、棉花等都已有商業(yè)化的品種問世;目前在世界上使用最多的轉基因商業(yè)化基因是抗除草劑基因和Bt殺蟲基因。而水稻作為一種主糧，商業(yè)化步伐遠遠慢于這幾種作物;目前最有可能商業(yè)化的轉Bt殺蟲基因的是中國與國際水稻所合作研制的“華恢1號”、“Bt汕優(yōu)63”和歐洲研制的富含維生素A的Golden rice[1，2]。

自從國家給轉基因水稻發(fā)放了安全證書，轉基因水稻的商業(yè)化成為了熱門的議題。目前農業(yè)部發(fā)放安全證書的轉基因水稻有抗蟲轉基因水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”，國家制定了關于作物和轉基因水稻的檢測方法標準[1，3]。國家質量檢測部門有完善的種子和食品檢測系統(tǒng)，來定性檢測是否含有轉基因成分。但是隨著轉基因水稻即將大規(guī)模的種植，科研人員在研究和育種過程也有大量的樣品需要檢測，主要目的有以下幾個：①更好地進行常規(guī)品種轉基因育種工作，防止轉基因的品種污染常規(guī)品種，保持種質的純合，同時檢測轉基因的水稻在田間有沒有發(fā)生漂移;②節(jié)省人力物力，大量的水稻樣品送到專門的質檢部門檢測價格昂貴;③有些檢測樣品中的轉基因成分元件，是超出國家質量標準檢測范圍的。

轉基因作物和轉基因食品的檢測方法有很多，例如PCR、Southern Blot、基因芯片等[4-7]。常規(guī)和便捷的方法是普通PCR以及由其衍生出的半定量PCR方法[8，9];在國內外使用的最多定性作用更強的是Real-time PCR[10-12]。多重PCR檢測方法被廣泛使用[4]。本文根據(jù)自己的一些實踐，總結出了在食品檢驗、科研或者育種工作中進行多重PCR檢測分析轉基因樣品中的幾個要點。

1 ?污染源的杜絕

轉基因檢測中，只有杜絕一切污染源，才有可能在后續(xù)的檢測中做出正確的判斷。如果沒有做好防止污染，很容易出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此所有的試劑須新鮮現(xiàn)配、滅菌，槍頭、離心管等要嚴格滅菌，玻璃器皿需要清洗干凈[13]。樣品必須防止交叉污染，條件允許的話，可以進口高質量的離心管、槍頭等，以便在后續(xù)的試驗中起到排除污染的作用[12]。

2 ?樣品DNA的提取方法

DNA的提取方法既可以采用經典的CTAB方法，也可以按照農業(yè)部的質檢標準書的方法，這兩種方法用于PCR和半定量PCR、Real-time熒光定量PCR都有很好的結果[3，14];條件允許的話，也可以采用試劑盒。有學者采用快速提取法獲得的轉基因番茄DNA，用于Real-time PCR檢測，取得了很好的結果;鑒于這一點，快速方法提取的轉基因水稻DNA，也應該可以適用于Real-time PCR的檢測，這就為檢測大量的水稻DNA樣品提供了便捷的途徑[3，15-17]。Cankar等[18]、Demeke等[19]在水稻轉基因檢測的實踐中，采取適用于RFLP分子標記檢測的水稻DNA快速提取法，取得了比較好的效果。endprint

3 ?轉基因水稻的多重PCR檢測

根據(jù)農業(yè)部的質檢標準書，采用的是多重PCR和Real-time PCR的方法。在轉基因的檢測中，有4個檢測元件：啟動子、終止子、靶基因、內參基因。轉基因的定性檢測中，首先要檢測的是內參基因，因為內參基因能確定DNA模板的質量;然后是檢測啟動子和終止子，在檢測出啟動子或者終止子以后，還要進一步檢測靶基因。只有兩個以上的轉基因元件被檢測出，才能定性為轉基因的水稻[3，4，9，20]。

3.1 ?內參基因的檢測

在定性檢測轉基因水稻中，會設置內參基因，農業(yè)部的質檢標準書采用的是水稻sps（蔗糖磷酸合成酶）基因[3，21];也可以采用常規(guī)試驗中經常用的水稻β-Actin基因的引物（在不同的物種中高度保守，組織和細胞中的表達相對恒定內參基因的檢測），可以對模板進行定性為水稻的DNA，同時可以根據(jù)PCR產物條帶的亮度來確定模板的質量。

3.2 ?啟動子的檢測

3.2.1 ?CaMV 35S啟動子的檢測 ?根據(jù)農業(yè)部制定的質檢標準書，在目前的轉基因水稻中的定性檢測一般檢查的是花椰菜病毒35S啟動子。早期的水稻轉基因多采用這個啟動子，這次農業(yè)部批準的“Bt汕優(yōu)63”也是采用的CaMV 35S啟動子。

3.2.2 ?含CaMV 35S啟動子的轉基因水稻和病毒感染的定性區(qū)分 ?轉基因食品中CaMV 35S啟動子中有一個關鍵性問題就是區(qū)別轉基因與病毒感染和污染[22-24]。在食品的安檢和十字花科蔬菜的轉基因定性檢測中，通常會檢測是否有CaMV 35S啟動子轉基因元件還是被花椰菜病毒感染了[22]。但是在確定沒有污染的情況下，檢測出35S啟動子并不能定性樣品含有轉基因成分。花椰菜病毒會感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因組也會整合到其侵染的植物基因組里面（感染水稻的可能性很?。?，在這種情況下，可以根據(jù)花椰菜病毒的外殼蛋白基因或復制酶基因設計特異性引物，也可以根據(jù)被花椰菜病毒感染后的特殊產物設計特異性引物，在轉錄水平上來定性是含CaMV 35S啟動子成分的樣品還是被花椰菜病毒感染了[25-31]。在一般情況下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，這項檢測只有在質量檢測要求特別嚴格的情況下會被采用。同時，通過定量熒光Real-time PCR也可以排除樣品是被花椰菜病毒感染或者污染還是轉基因，具體的方法參見后文關于熒光PCR定量檢測的內容[3，10]。

3.2.3 ?其他啟動子 ?隨著轉基因技術的不斷發(fā)展，更多被農業(yè)科學家采用的是組織特異性的啟動子，例如新一代的轉基因水稻就是采用組織特異性表達的啟動子[32]。因此，隨著轉基因水稻品種越來越多，更多種類的啟動子檢測將會出現(xiàn)在質檢標準中[33]。

3.3 ?終止子的檢測

3.3.1 ?植物基因工程的原理 ?根癌農桿菌的Ti質粒和發(fā)根農桿菌的Ri質粒，其特定部位能與植物的DNA發(fā)生整合，因此常被用作植物基因工程中的載體。

3.3.2 ?Nos終止子 ?在轉基因植物中，常采用Nos終止子來構建載體，“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”也是采用的Nos終止子， 因此可以按照農業(yè)部的質檢標準書用PCR定性檢測Nos終止子[3，34]。Nos終止子是農桿菌菌株Ti質粒的T-DNA上的胭脂堿合成酶的終止子。胭脂堿屬于冠癭堿，在與植物共生或者轉化植物以后，會釋放出對植物有害的毒素，因此在Ti質粒上構建載體的過程中，會剪切掉這個基因，但是會保留這個基因的終止子（Nos），并通常用這個Nos終止子作為轉基因的終止子[35]。

3.3.3 ?其他終止子 ?植物轉基因的構建方法表明，轉基因載體基本采用的是農桿菌T-DNA上的冠癭堿的終止子。農桿菌的不同菌株含有不同Ti質粒，其包含的T-DNA上的冠癭堿也不同。例如，農桿菌菌株LBA4404的毒性區(qū)來自章魚堿型質粒，農桿菌菌株GV3101的毒性區(qū)來自胭脂堿型質粒，農桿菌菌株EA101、EA105的毒性區(qū)來自琥珀堿型質粒。冠癭堿有4種類型：章魚堿（Octopine）、胭脂堿（Nopaline）、農桿堿（Agropine）、琥珀堿（Succinamopine），其終止子分別為 Ocs、Nos、Ags、Sus。在基因工程上最常用的是上面提到的胭脂堿型質粒和它的Nos終止子，其次就是章魚堿型質粒和它的Ocs終止子[36-38]。因此在轉基因的定性檢測中，可以根據(jù)每個實驗室采用的質粒和構建方法的不同，設計別的終止子引物，例如Ocs終止子的引物[35]。

3.4 ?靶基因的檢測

最近中國頒發(fā)安全證書的“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號”都是轉基因抗蟲水稻，是高抗鱗翅目害蟲轉基因水稻品系;含有Bt融合型殺蟲蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab[1]。對這兩種轉基因水稻的檢測，需要根據(jù)Bt融合殺蟲蛋白的基因來設計引物。

隨著越來越多的轉基因水稻將要獲批準上市，農業(yè)科研單位在種質創(chuàng)新和科研中的需要，會有更多的農用基因在檢測中出現(xiàn)[33]。

3.5 ?標記基因的檢測

在轉基因水稻中常會含有GUS基因、抗生素基因、除草劑等標記基因，因此也可以對這些轉基因元件進行檢測;但是隨著轉基因技術的發(fā)展，在現(xiàn)階段轉基因育種中，標記基因在后期的工作中通常用共轉化等方法被剔除掉，這樣剔除了標記基因的品種才更安全，才會用于商業(yè)化[39，40]。因此，標記基因的檢測在早期的轉基因篩選檢測中會用到，但是在后期的育種鑒定一般不會采用。不過也可以用在轉基因的后期工作中，鑒定品種是否進一步剔除了標記基因。

4 ?模板和引物endprint

根據(jù)農業(yè)部的質檢標準書，采用的是含有“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號”的DNA作為陽性模板，并采用CaMV 35S啟動子、Nos終止子、Bt融合蛋白基因和內參基因來檢測樣品;陽性模板應該為單拷貝插入，這樣將便于在定量熒光PCR的分析。

由于樣品的不確定性，在進行上述檢測以外，還可以采用別的模板和引物來檢測可能出現(xiàn)的其他種類的轉基因元件。例如Ocs終止子、抗除草劑基因、花椰菜病毒的基因、韌皮部特異性表達啟動子等。如果沒有現(xiàn)成的水稻DNA模板，含有這些元件基因的質粒也可以被選作模板，在做PCR的過程中，要根據(jù)試劑盒中的說明，水稻模板DNA和質粒DNA要選擇不同的終濃度[41，42]。引物要送到技術質量好的公司合成，模板要保證質量和選擇的正確性，防止反應出現(xiàn)假陰性、假陽性。

5 ?轉基因產品的定量Real-time PCR的定性分析作用

轉基因中的定量實時熒光PCR是為普通PCR做補充的。由于轉基因的普通PCR檢測靈敏度達到0.1%[20]， 而且花椰菜病毒的35S啟動子非常容易污染檢測樣品，在沒有別的辦法排除樣品被污染或病毒感染的情況下，實時熒光PCR可以提供非常好的分析數(shù)據(jù)[3，10，12]。以被含CaMV 35S啟動子的外源物污染和被病毒感染的樣品為例，分析如下：第一，樣品被含有CaMV 35S啟動子的外源物污染。這種情況下熒光PCR會檢測出35S啟動子，但是其豐度會比單拷貝轉基因DNA陽性模板的豐度要低;第二，樣品被病毒感染。由于病毒一般不會感染植物的每個細胞，因此檢測出來的啟動子豐度也會比單拷貝轉基因的DNA陽性模板要低。因此可以根據(jù)定量PCR來區(qū)分樣品是轉基因還是被污染或者被病毒感染了[9，10]。

6 ?小結

針對這次農業(yè)部發(fā)放安全證書的兩個轉基因水稻品種“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號”的PCR定性檢測，可以選取含有啟動子CaMV 35S、終止子Nos、含有Bt融合蛋白基因的轉基因水稻DNA作為陽性模板，選取非轉基因水稻DNA作為陰性模板，對水稻DNA樣品進行檢測。但這種檢測只能定性檢測出樣品是不是“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號”，國內外的實驗室在轉基因生產育種中，還生產了很多其他的轉基因水稻品種，采用的轉基因元件跟這兩個是不完全一樣的，甚至完全不一樣。對一個未知樣品完全定性確定是否為轉基因的水稻，還需要多設計出幾對引物（其他終止子、啟動子、靶基因）進行檢測。由于越來越多的轉基因品種并非采用的CaMV 35S的啟動子，而且這個啟動子在檢測中很容易受到污染和病毒感染的干擾，因此檢測終止子反而更為可靠?，F(xiàn)有的報道結果表明，在構建植物基因工程載體中，基本上采用的是農桿菌的T-DNA上的冠癭堿的終止子（Nos終止子、Ocs終止子），因此，可以根據(jù)這些終止子設計引物組，對未知樣品進行檢測。此外，本研究也可以在實踐中摸索出快速提取水稻DNA的方法，提取的DNA質量可以適用于Real-time PCR和半定量常規(guī)PCR，可以為大量的轉基因水稻樣品檢驗提供便捷。

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