羅衛(wèi) 謝純良 嚴(yán)理 朱作華 李智敏 胡鎮(zhèn)修 彭源德

摘要：為了尋找有效提取杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel）菌絲胞外酶的方法，為杏鮑菇等食用菌胞外酶的活性研究和生長(zhǎng)規(guī)律提供試驗(yàn)依據(jù)，研究通過(guò)pH 4.8的檸檬酸緩沖液、去離子水2種處理方式提取杏鮑菇菌絲胞外酶，并通過(guò)測(cè)定8種胞外酶酶活來(lái)對(duì)這2種方式進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，2種提取方式對(duì)杏鮑菇菌絲胞外酶的酶活有差異，其中，酸性纖維素酶和果膠酶經(jīng)酸處理酶活是水處理的2倍多;木聚糖酶和木質(zhì)素降解相關(guān)酶類經(jīng)酸處理的酶活也高于水處理，但淀粉酶和蛋白酶經(jīng)酸處理酶活低于水處理。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇（Pleurotus eryngii）;胞外酶;酸處理;水處理;比較分析

中圖分類號(hào)：S646.1+4 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0427-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.043

Comparative Analyses of Two Methods of Extracting Extracellular Enzymes

from Pleurotus eryngii

LUO Wei，XIE Chun-liang，YAN Li，ZHU Zuo-hua，LI Zhi-min，HU Zhen-xiu，PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205，China）

Abstract： In order to find effective methods of extracting extracellular enzymes from Pleurotus eryngii mycelium and provide reliable experimental basis for studying activity of extracellular enzyme and regulating growth of Pleurotus eryngii or other edible fungi， two approaches including acid（citrate buffer at pH 4.8） and distilled water process were used to extract extracellular enzymes from Pleurotus eryngii mycelium. Activities of eight extracellular enzymes were determined to compare the two methods. The results showed that the two extraction methods had significant differences in activity of extracellular enzyme. The activity of Pectinase and cellulase extracted with acid was twice as that of water. The activities of xylanase， pectinase and lignin related enzymes after acid treatment were higher than that of water. The activities of amylase and protease in acid extraction was lower than that in water extraction.

Key words： Pleurotus eryngii Qual; extracellular enzymes; acid extraction; water extraction; comparative analysis

研究食用菌胞外酶的活性，對(duì)了解不同食用菌的胞外酶分泌特點(diǎn)、活性大小及動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)、推測(cè)不同食用菌在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素、淀粉等大分子營(yíng)養(yǎng)成分的降解動(dòng)態(tài)、提高栽培技術(shù)有重要的意義[1]。在研究胞外酶活性時(shí)，能夠有效提取菌絲胞外酶是測(cè)定酶活性的前提。因此，選擇一種有效的提取菌絲胞外酶的方法對(duì)研究胞外酶的活性具有重要意義。目前，食用菌胞外酶的提取方法主要有2種：一是用水處理的方式提取[2-4];二是用酸處理的方式提取[5]。到目前為止，尚未見(jiàn)有人用同一種酶對(duì)這兩種提取方式進(jìn)行比較分析。由于儀器和試驗(yàn)操作等方面的誤差，使得酸性纖維素酶、果膠酶，木聚糖酶、淀粉酶等胞外酶的提取尚無(wú)可以參考的標(biāo)準(zhǔn)。從研究的需要出發(fā)，本研究以杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel）菌絲為研究對(duì)象，通過(guò)酸、水2種不同的處理方式提取杏鮑菇菌絲胞外酶，并通過(guò)測(cè)定酶的活性對(duì)這2種方式進(jìn)行分析比較，以期找到一種有效的提取胞外酶的方法，為今后杏鮑菇等食用菌胞外酶的提取提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試菌株

杏鮑菇“杏-1”，由湖南省食用菌研究所提供，杏鮑菇栽培采用棉子殼培養(yǎng)基：71%棉子殼、21%麥麩、4%玉米粉、2%白糖、2%碳酸鈣，自然pH，含水量60%。采用常規(guī)方式拌料、裝袋，100 ℃滅菌18 h，冷卻后接杏鮑菇栽培種，每一菌袋接栽培種約3 g，置入 22～25 ℃、濕度75%、CO2濃度在500～1 000 mg/kg的條件下培養(yǎng)，大概35 d長(zhǎng)滿菌絲[6]。

1.2 ?試劑

羧甲基纖維素鈉、木聚糖、果膠和半乳糖醛酸為Sigma公司產(chǎn)品，檸檬酸、無(wú)水葡萄糖、木糖、乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰聯(lián)甲苯胺、纖維二糖、丙二酸，丙二酸鈉、ABTS、黎蘆醇、果膠、硫酸錳、牛血清蛋白、PBS緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染液、酒石酸、雙氧水、酒石酸甲鈉、3，5-二硝基水楊酸、可溶性淀粉為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 ?試驗(yàn)方法

1.3.1 ?粗酶液制備 ?菌絲長(zhǎng)滿菌袋后， 在袋中取長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)料充分混勻，然后取40 g均勻分成2份，一份加去離子水（以下簡(jiǎn)稱水）50 mL，一份加pH 4.8檸檬酸緩沖液（以下簡(jiǎn)稱酸）50 mL，20 ℃振蕩浸提4 h，過(guò)濾后，4 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 ? 木質(zhì)素降解相關(guān)酶類酶活測(cè)定

1）漆酶酶活的測(cè)定。相關(guān)試劑配置和酶活計(jì)算公式參照Wolfenden等[7]的方法，其酶活單位定義為1 min催化l mol底物的酶量。準(zhǔn)確移取100 mmol/L丙二酸—丙二酸鈉緩沖液、0.6 mmol/L ABTS溶液各10 mL。混合搖勻，30 ℃水浴。取上述混合試劑l mL于1.4 mL的比色皿中，420 nm處調(diào)零。準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液X μL（X=0～50），立即記錄吸光度。每隔30 s記錄1次，共3次。取平均值，折算成每分鐘的吸光度變化（OD420變化）。

2）錳過(guò)氧化物酶酶活的測(cè)定。相關(guān)試劑配置和酶活計(jì)算公式參照Wariishi等[8]的方法，其酶活單位定義為l min氧化1 μmol MnSO4的酶量。準(zhǔn)確移取100 mmol/L丙二酸—丙二酸鈉緩沖液0.5 mL于1.4 mL的比色皿中，加入10 mmol/L MnSO4溶液0.1 mL，準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液X μL （X=0～50），加入去離子水（400-X） μL，30 ℃水浴，加入濃度為10 mmol/L H2O2溶液0.01 mL啟動(dòng)反應(yīng)，迅速測(cè)定270 nm處的吸光度，l min后再測(cè)定1次，計(jì)算二者之差，即為每分鐘的吸光度變化（OD270變化）。

3）木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活的測(cè)定。相關(guān)試劑配置和酶活計(jì)算公式參照Tien等[9]的方法，其酶活單位定義為1 min氧化l μmol黎蘆醇的酶量。準(zhǔn)確移取200 mmol/L酒石酸緩沖液0.5 mL于1.4 mL的比色皿中，加入40 mmol/L黎蘆醇0.1 mL。準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液X μL （X=0～100），加入去離子水（400-X） μL，30 ℃水浴，加入濃度為20 mmol/L H2O2溶液0.01 mL啟動(dòng)反應(yīng)，迅速測(cè)定310 nm處的吸光度，1 min后再測(cè)定1次，計(jì)算二者之差，即為每分鐘的吸光度變化（OD310變化）。

1.3.3 ?酸性纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶酶活的測(cè)定

1）酸性纖維素酶酶活的測(cè)定。相關(guān)溶液和試劑的配置參照Mandels等[10]的方法，取3支試管各加入0.5 mL酸性CMC底物，與待測(cè)酶液一起在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min。在第一、二支試管中各加入0.5 mL待測(cè)酶液，50 ℃水浴中反應(yīng)15 min。在3支試管中各加入3 mL的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5 mL的待測(cè)酶液。搖勻3支試管后，在沸水浴中煮5 min。水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對(duì)照在540 nm下測(cè)第一、二支試管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/15/0.5）×稀釋倍數(shù)。

2）果膠酶酶活的測(cè)定。相關(guān)溶液和試劑的配置參照王玉萬(wàn)等[11]的方法，取3支試管各加入0.5 mL 0.25%聚半乳糖醛酸溶液，與待測(cè)酶液一起在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min。在第一、二支試管中各加入0.5 mL待測(cè)酶液，50 ℃水浴中反應(yīng)15 min。在3支試管中各加入3 mL的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5 mL的待測(cè)酶液。搖勻3支試管后，在沸水浴中煮5 min。水浴冷卻至室溫后，將空白液置4 000 r/min離心機(jī)中離心5 min后取上清液作為空白對(duì)照。以第三支試管為對(duì)照在540 nm下測(cè)第一、二支試管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/15/0.5）×稀釋倍數(shù)。

3）木聚糖酶酶活的測(cè)定。相關(guān)溶液和試劑的配置參照Shamala等[12]的方法。采用DNS法，取3支試管各加入0.5 mL中性木聚糖底物，與待測(cè)酶液一起在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min。在第一、二支試管中各加入0.5 mL待測(cè)酶液，50 ℃水浴中反應(yīng)15 min。在三支試管中各加入3 mL的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5 mL的待測(cè)酶液。搖勻3支試管后，在沸水浴中煮10 min。水浴冷卻至室溫后，將顯色液（包括空白）以4 000 r/min離心5 min。取上清液以第三支試管為對(duì)照在540 nm下測(cè)第一、二支試管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/150/15/0.5）×稀釋倍數(shù)。

1.3.4 ? 淀粉酶、蛋白酶酶活的測(cè)定

1）淀粉酶酶活的測(cè)定。相關(guān)溶液和試劑配置參照管道平[5]的方法，在3支試管中加入1%可溶性淀粉溶液1 mL，加入pH 4.8、0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液4 mL，去離子水1 mL，在第一、第二支試管中加入酶液l mL，40 ℃水浴中保溫30 min。在3支試管中各加入3 mL的DNS，然后在第三支試管加入1 mL的酶液。搖勻3支試管在沸水浴中煮5 min。水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對(duì)照在540 nm下測(cè)第一、二支試管的吸光度。酶活單位定義為每小時(shí)酶促生成l mg葡萄糖的酶量。

2）蛋白酶酶活的測(cè)定。相關(guān)溶液和試劑的配置參照Bradford[13]的方法，將適當(dāng)體積的樣品加入到試管中，并用PBS補(bǔ)足到150 μL，向各試管中加入2.85 mL的考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，溫室放置5～10 min，用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處的吸光度，并記錄讀數(shù)，以不含BSA的樣品作為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?木質(zhì)素降解相關(guān)酶類酶活測(cè)定結(jié)果

木質(zhì)素降解相關(guān)酶類經(jīng)酸、水處理后所測(cè)得的酶活如表1和圖1所示。由圖1可知，木質(zhì)素相關(guān)酶類酶活酸處理與水處理相比有差異，酸處理酶活均高于水處理酶活。

2.2 ? 酸性纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果

酸性纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶經(jīng)酸、水處理后所測(cè)得的酶活如表2和圖2所示。由圖2可知，杏鮑菇菌絲經(jīng)酸處理酶活與水處理相比有顯著差異，其中酸性纖維素酶酸處理酶活是水處理的2倍多;果膠酶酸處理酶活是水處理的2倍多，木聚糖酸處理酶活是水處理的1倍多。

2.3 ?淀粉酶、可溶性蛋白酶酶活測(cè)定結(jié)果

淀粉酶、可溶性蛋白酶經(jīng)酸、水處理后所測(cè)得的酶活如表3和圖3所示。由圖3可知，杏鮑菇菌絲酸處理酶活與水處理相比有差異，酸處理酶活低于水處理。

3 ?小結(jié)與討論

本研究采用2種不同的處理方式提取杏鮑菇菌絲胞外酶，并對(duì)2種處理方式的結(jié)果進(jìn)行比較分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，酸性纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶經(jīng)酸處理后測(cè)定的酶活與水處理相比有差異，其中酸性纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶酸處理酶活與水處理相比有顯著的差異。但淀粉酶和蛋白酶的酸處理酶活不及水處理效果，初步分析，可能是淀粉酶和蛋白酶的最適pH接近中性，而pH 4.8的檸檬酸緩沖液偏酸性，抑制了部分淀粉酶和蛋白酶的活性，從而導(dǎo)致所測(cè)得酶活低，但是具體的反應(yīng)機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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