王清 張勇躍 孟凡奇 劉志堅 繆衛(wèi)國

摘要：試驗(yàn)前期通過構(gòu)建相應(yīng)敲除載體，采用電轉(zhuǎn)化的方法，分別獲得Xanthmonas. citri subsp. malvacearum（簡稱Xcm）菌株的hpaXm基因缺失突變菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突變菌株V8ΔhpaXm-IP。通過特殊生長平板及煙草接種試驗(yàn)表明，與V8菌株相比，突變菌株胞外多糖產(chǎn)量以及胞外纖維素酶、脂酶活性不變，V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性顯著降低;3種菌株都不能產(chǎn)生胞外蛋白酶;突變菌株在煙草上形成的壞死斑面積變小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因與病菌胞外淀粉酶活性及病菌激發(fā)煙草過敏反應(yīng)的能力有關(guān)，與胞外多糖、纖維素酶、蛋白酶和脂酶產(chǎn)生無關(guān)。同時預(yù)示了hpaXm-IP可能具有牽引HpaXm蛋白泌出的能力，且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激發(fā)煙草HR的活性物質(zhì)，hpaXm及hpaXm-IP可能會影響V8菌株的致病性，但不是必然的。

關(guān)鍵詞：棉花角斑病菌;細(xì)菌病害;表型;過敏反應(yīng);胞外多糖;胞外酶

中圖分類號： S435.621.2+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0116-04

收稿日期：2019-03-08

基金項(xiàng)目：國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號：CARS-10-C-13）;國家自然科學(xué)基金（編號：31360029、31160359）;教育部博士點(diǎn)基金（編號：20124601110004、20104601110004）;國家重大基礎(chǔ)研究計劃（編號：2011CB111612）;國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（編號：CARS-34-GW8）。

作者簡介：王?清（1988—），女，河南項(xiàng)城人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事植物保護(hù)等研究。E-mail：1173823088@qq.com。

通信作者：繆衛(wèi)國，博士，教授，主要從事分子植物病理等研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。

棉花細(xì)菌性角斑病是我國最早報道的重要細(xì)菌病害，在整個生育期都可侵染棉花，該病害對棉花生長過程造成較大的負(fù)面影響[1]。棉花角斑病菌于2006年正式定名為Xanthmonascitri subsp. malvacearum nov.comb.nov.nom.nov.（簡稱Xcm）[2]，屬黃單胞菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌，在含有營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)基平板上，菌落形態(tài)為近圓形，顏色逐漸由淡黃色變?yōu)橄烖S，邊緣完整且微凸[1]。1986年決定病原菌對寄主植物致病性和誘導(dǎo)非寄主及抗病植物過敏性反應(yīng)（HR）的hrp基因在菜豆暈斑病菌中被首次報道[3-4];1992年，人們從梨火疫病菌中發(fā)現(xiàn)由hrpN基因編碼的第1個Harpin類蛋白HarpinEa[5]，隨后眾多由hrp類基因編碼的Harpin蛋白相繼被克隆表達(dá)出來，目前大部分Harpin蛋白可激發(fā)煙草HR、異位效應(yīng)等，且具有促生長等作用[6]，對應(yīng)編碼基因被普遍研究。由于棉花角斑病菌V8小種存在限制性修飾系統(tǒng)，一直未能對其特定基因進(jìn)行定點(diǎn)突變[7]，因此關(guān)于hpaXm、hpaXm-IP基因?qū)8小種生物學(xué)特性和煙草過敏反應(yīng)的影響暫未見報道。

hpaXm基因是從V8小種XCM143基因組DNA中克隆的全長為402 bp的序列[6]，能編碼定位于hrp區(qū)域的Harpin類蛋白HpaXm?？娦l(wèi)國通過信號肽軟件Signal 3.0 server對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和GST-HpaXm融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，HpaXm的N端前15個氨基酸是存在的信號肽，且信號肽缺失后該蛋白不能正常泌出胞外，hpaXm-IP則是編碼該信號肽的長為45 bp的基因序列[2]，這預(yù)示HpaXm蛋白的泌出方式可能不同于其他Harpin蛋白。本研究將突變菌株V8ΔhpaXm和V8Δhp6aXm-IP進(jìn)行特殊營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)基生長試驗(yàn)以及煙草HR測定，分析hpaXm及hpaXm-IP基因?qū)8菌株生物學(xué)特性及其激發(fā)煙草HR能力的影響，以期為后續(xù)突變菌株致病性、Harpin蛋白泌出途徑及缺失N端45個氨基酸對Harpin蛋白的影響等相關(guān)研究提供相關(guān)科學(xué)參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?相關(guān)基因?hpaxm基因從Xcm基因組中通過PCR擴(kuò)增獲得;hpaXm-IP基因?yàn)閔paxm基因中長為45 bp的編碼HpaXm蛋白N端類似信號肽序列的一段基因。

1.1.2?菌株?試驗(yàn)用菌株棉花角斑病菌（Xanthmonas. citri subsp. malvacearum，Xcm）V8菌株（8號小種）從棉花上分離獲得，V8ΔhpaXm-IP以hpaxm為靶基因構(gòu)建敲除載體通過電轉(zhuǎn)化野生菌Xcm同源重組獲得;V8ΔhpaXm菌株以hpaXm-IP為靶基因構(gòu)建敲除載體通過電轉(zhuǎn)化野生菌Xcm同源重組獲得[7]。

1.1.3?敲除載體?敲出載體的詳細(xì)構(gòu)建過程參照文獻(xiàn)[7]。

1.1.4?植物?以盆栽種植的6～8葉期本氏煙煙株為試驗(yàn)植物。

1.1.5?試劑?氯化鈉、牛肉浸膏、蔗糖、胰化蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、氫氧化鈉[生工生物工程（上海）股份有限公司];卡那霉素、脫脂牛奶、可溶性淀粉、碘、碘化鉀、羧甲基纖維素、剛果紅、二水合氯化鈣等（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.6?培養(yǎng)基?NB培養(yǎng)基：5 g聚蛋白胨，3 g牛肉浸膏，1 g酵母粉，10 g蔗糖，加水900 mL，攪拌至均勻，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8，定容至 1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。NA培養(yǎng)基是在NB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g瓊脂配制而成的。

1.2?菌株生物學(xué)特性的研究

胞外多糖產(chǎn)量的測定參考馮雯杰的方法[8]，胞外酶等活性的測定參考Slater等的方法[9]，其中胞外酶活性以水解圈或者透明圈直徑和菌落直徑大小的比值表示。

1.3?菌株激發(fā)的煙草過敏反應(yīng)

菌株激發(fā)的煙草過敏反應(yīng)參考李小杰的方法[10]進(jìn)行檢測。

2?結(jié)果與分析

2.1?hpaXm及hpaXm-IP基因?qū)8菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

從圖1可以看出，突變菌株1、3和野生菌株2的菌落形態(tài)及顏色基本一致，均表現(xiàn)為豐滿、隆起，表面光滑且具光澤;統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果（圖2）表明，突變菌株與V8菌株的胞外多糖產(chǎn)量并無顯著差異。說明hpaXm及hpaXm-IP基因不具有調(diào)控V8菌株胞外多糖合成與泌出的作用。

2.2?hpaXm及hpaXm-IP基因?qū)8菌株胞外酶活性的影響

2.2.1?胞外淀粉酶活性變化?突變菌株單菌落周圍形成的透明圈都變?。▓D3），統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果（圖4）表明，V8ΔhpaXm-IP菌株與V8菌株的胞外淀粉酶活性大小無顯著差異;V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性與V8菌株相比則顯著上升。表明 hpaXm-IP基因?qū)8菌株的胞外淀粉酶活性沒影響，hpaXm基因可在一定程度上抑制V8菌株胞外淀粉酶的活性或產(chǎn)生。

2.2.2?胞外纖維素酶活性變化?從圖5可以看出，各菌株單菌落形成的透明圈大小基本一致，統(tǒng)計結(jié)果（圖6）表明，V8ΔhpaXm、V8ΔhpaXm-IP菌株與V8菌株的胞外淀粉酶活性大小均無顯著性差異。表明hpaXm及hpaXm-IP基因與V8菌株胞外纖維素酶的活性無明顯相關(guān)關(guān)系。

2.2.3?胞外蛋白酶活性變化?從圖7可以看出，3種菌株單菌落在脫脂牛奶平板上都不形成透明圈，表明V8菌株不能產(chǎn)生胞外蛋白酶。統(tǒng)計分析結(jié)果（圖8）表明，V8ΔhpaXmV8和V8ΔhpaXm-IP菌株的菌落大小與V8菌株相比均極顯著下降。表明hpaXm、hpaXm-IP基因影響V8菌株在脫脂牛奶平板上的生長能力。

2.2.4?胞外脂酶活性變化?從圖9可以看出，突變菌株的單菌落周圍形成的雪花狀圈與V8菌株相比基本沒變化，表明hpaXm及hpaXm-IP基因的缺失不影響V8菌株產(chǎn)生胞外脂酶的活性。

2.3?hpaXm及hpaXm-IP基因?qū)8菌株激發(fā)煙草HR能力的影響

從圖10可以看出，在接種24 h后，突變菌株與V8菌株在煙草上的接種部位均可形成壞死斑，但突變菌株接種部位的壞死斑面積減小，初步推測，hpaXm及hpaXm-IP基因都能影響V8菌株激發(fā)煙草HR的能力。

3?討論與結(jié)論

黃單胞菌產(chǎn)生的胞外多糖具有黏附性，能促使細(xì)菌附著于葉片上，不僅阻礙宿主水分運(yùn)輸，還能螯合激發(fā)免疫需要的信號Ca2+等，可抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制，從而對其致病性起重要作用[3，11]。胞外酶可以幫助革蘭氏陰性細(xì)菌降解摧毀植物的第1道防線——細(xì)胞壁，一旦發(fā)生分泌缺陷，其致病力會降低[12]。hrp基因突變對革蘭氏陰性病原細(xì)菌激發(fā)非寄主植物HR和致使寄主植物發(fā)病能力的影響并不規(guī)律。

hpaXm基因缺失對V8菌株的胞外多糖產(chǎn)量及胞外纖維素酶、脂酶活性無明顯影響，但使V8菌株胞外淀粉酶活性顯著下降，且V8ΔhpaXm在煙草上形成的壞死斑面積變小。據(jù)報道，水稻白葉枯病菌一旦不能產(chǎn)生胞外蛋白酶，其致病性變?nèi)跚揖w繁殖數(shù)量減少[13];甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的胞外蛋白酶也可能通過幫助其在寄主中擴(kuò)展或克服寄主的防衛(wèi)反應(yīng)而參與致病過程[14]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，V8菌株自身無法產(chǎn)生胞外蛋白酶。研究表明，hpa2基因突變的野油菜黃單胞菌Xcc 8004激發(fā)非寄主植物HR的能力喪失[15];hrpN發(fā)生突變會導(dǎo)致梨火疫病菌的致病性和HR完全喪失[16];水稻黃單胞菌的hrpXoo基因則對水稻致病性和煙草過敏反應(yīng)具有決定性作用[17];但hpaH基因突變后，菌株Xag Bra可激發(fā)非寄主植物番茄和白菜上產(chǎn)生HR，而使辣椒和煙草喪失了產(chǎn)生HR的能力[18]。V8ΔhpaXm菌株在煙草上形成壞死斑的面積僅僅變小，并未完全消失，說明hpaXm基因缺失會使V8菌株激發(fā)煙草HR的能力下降但不會喪失，hpaXm基因并不完全決定著V8菌株激發(fā)煙草HR的能力，HpaXm蛋白也不是V8產(chǎn)生的能夠激發(fā)煙草HR的唯一活性物質(zhì)。

hpaXm-IP基因缺失對V8菌株的胞外多糖產(chǎn)量及胞外纖維素酶、淀粉酶及脂酶活性無明顯影響。V8ΔhpaXm-IP菌株在煙草上形成的壞死斑面積與V8菌株相比變小，說明hpaXm-IP缺失只是降低了V8菌株激發(fā)煙草HR的能力。一些Ⅲ型效應(yīng)蛋白的分泌會依賴其N端序列，如若刪除水稻黃單胞菌基因avrBs1 N端的第1～58個密碼子，其編碼蛋白將無法從T3SS泌出[19]。結(jié)合前期的相關(guān)預(yù)測推測，V8ΔhpaXm-IP菌株激發(fā)煙草HR的能力減弱，一方面可能是由于hpaXm-IP具有牽引HpaXm蛋白泌出的能力，hpaXm-IP基因的缺失使得HpaXm蛋白不能正常泌出胞外;另一方面可能是由于HpaXm蛋白激發(fā)煙草HR的部分功能區(qū)域是其前15個氨基酸片段。很多突變的革蘭氏陰性病原菌通常一旦喪失了激發(fā)非寄主植物HR的能力，那么在寄主植物上的致病力也會相應(yīng)的喪失[20]，至于hpaXm及hpaXm-IP基因是否決定V8菌株在寄主棉花上的致病性，仍需要進(jìn)一步深入研究。

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