張丹 陶燕鐸 談利紅 余保 顏學(xué)偉 曹緯國(guó)

摘要： 為建立渝產(chǎn)續(xù)斷（Dipsacus asperoids）多糖的最佳超聲波輔助提取工藝，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以續(xù)斷多糖的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)續(xù)斷多糖的超聲波輔助提取工藝參數(shù)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，最佳超聲波輔助提取工藝為料液比1∶20（g∶mL），提取時(shí)間60 min，提取4次，測(cè)得續(xù)斷多糖的平均提取率為7.472%，RSD為2.12%，表明續(xù)斷多糖超聲波輔助提取工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

關(guān)鍵詞： 續(xù)斷（Dipsacus asperoids）;多糖;正交試驗(yàn);超聲波輔助

中圖分類號(hào)：S567.23+9;R284.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0431-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.044

Optimizing Microwave-Ultrasonic Assisted Technology of Extracting Ploysaccharide from Dipsacus asperoids in Chongqing City with Orthogonal Design

ZHANG Dan1，TAO Yan-duo2，TAN Li-hong1，YU Bao1，YAN Xue-wei1，CAO Wei-guo1

（1. TCM College，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016， China;

2. The Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810000， China）

Abstract： To establish the optimal microwave-ultrasonic assisted technology of extracting polysaccharides from Dipsacus asperoids in Chongqing city， orthogonal experiment was conducted. The extraction percentage of polysaccharides was used as an evaluation index to screen the parameters of the microwave-ultrasonic assisted technology of extracting polysaccharides from Dipsacus L.. The ratio of materials to liquids was 1∶20（g∶mL）， with 4 times of 2 h. The average extraction rate was 7.472%. RSD was 2.12%. The extraction was stable with controllable quality.

Key words： Dipsacus asperoids; polysaccharides; orthogonal experiment; microwave-ultrasonic assisted

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（Dipsacus asperoids）的干燥根[1]，又名川斷，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效，主要用于胎漏、胎動(dòng)不安、滑胎、腰膝酸軟、跌打損傷和骨折等癥。續(xù)斷化學(xué)成分研究已較為深入，且多集中于其皂苷類成分[2，3]，已有研究表明續(xù)斷類藥材多糖含量較高，重慶作為續(xù)斷的主產(chǎn)區(qū)之一，目前尚未有關(guān)于重慶產(chǎn)續(xù)斷多糖的研究報(bào)道。多糖尤其是中藥多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，因此續(xù)斷藥材中含量較高的多糖類成分具有潛在的研究?jī)r(jià)值。本試驗(yàn)以重慶產(chǎn)續(xù)斷為原料，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選續(xù)斷多糖的超聲波輔助提取工藝，為續(xù)斷多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ? 材料與儀器

續(xù)斷藥材采自重慶武隆后坪鄉(xiāng)，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)王剛副教授鑒定為川續(xù)斷。

UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）;AL204型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多集團(tuán)）;KH5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），DGG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供，批號(hào)為110833），濃硫酸、正丁醇、氯仿、丙酮、無水乙醇、95%乙醇、石油醚、純凈水等均為分析純。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 ?室溫下精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品51.8 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻即得。

1.2.2 ?供試品溶液的制備 ?稱取已烘干的續(xù)斷藥材粉末10 g，置圓底燒瓶中加入80 mL石油醚回流提取脫脂，共計(jì)2次，每次2 h。藥渣揮去溶劑后，加入80 mL 95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，藥渣揮去溶劑后，加水200 mL，100 ℃水浴提取5次，每次2 h，合并提取液，濃縮并定容至1 000 mL，即得供試品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 ?吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，得系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各吸取0.5 mL置于10 mL具塞試管中，再分別加入5%苯酚1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸4.0 mL，搖勻后30 ℃水浴30 min，冰水浴冷卻15 min，在489 nm下測(cè)定其吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[4，5]。

1.2.4 ?正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[6，7] ?選定影響多糖提取率的料液比（g∶mL，下同）、提取時(shí)間以及提取次數(shù)作為考察因素，以多糖提取率作為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)考察各因素的影響，因素與水平見表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密量取供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.05 mL，置5 mL容量瓶中，分別加1.0 mL去離子水、4%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，40 ℃水浴加熱15 min，置冰水浴中冷卻5 min，以相應(yīng)的試劑為空白，同時(shí)制備供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的未顯色樣品，按照紫外可見分光光度法，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，續(xù)斷多糖與葡萄糖樣品顯色后均在489 nm處有最大吸收，且對(duì)應(yīng)未顯色樣品在489 nm處基本沒有吸收，結(jié)果見圖1。因此選擇489 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，得系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=7.87C+0.004 36，r=0.999 3，結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0.010 36～0.103 60 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

以續(xù)斷多糖的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選續(xù)斷多糖的超聲波輔助提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2極差分析可知，各因素的主次順序?yàn)锳、C、B，最佳提取工藝為A2C3B3，即用1∶20的料液比提取4次，提取時(shí)間為60 min，且續(xù)斷多糖超聲波輔助提取工藝中一定要控制好料液比和提取次數(shù)。分別精密稱取3份續(xù)斷藥材，每份50 g，依據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝條件提取續(xù)斷多糖，結(jié)果測(cè)得續(xù)斷多糖的平均提取率為7.472%，RSD為2.12%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 ?小結(jié)與討論

本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，初步建立了渝產(chǎn)續(xù)斷多糖的超聲波輔助提取工藝為料液比1∶20，提取時(shí)間為60 min，提取4次，結(jié)果測(cè)得續(xù)斷多糖的平均提取率為7.472%，RSD為2.12%，表明該工藝穩(wěn)定可行，為渝產(chǎn)續(xù)斷的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。與已有研究結(jié)果[8-10]相比，渝產(chǎn)續(xù)斷多糖含量高于黔產(chǎn)續(xù)斷和五鶴續(xù)斷，說明續(xù)斷多糖的含量產(chǎn)地差異性較大，重慶為續(xù)斷主產(chǎn)區(qū)，續(xù)斷質(zhì)量較優(yōu)。

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，顏色持久，在490 nm左右有最大吸收，采用紫外可見分光光度法測(cè)定，簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重復(fù)性好。

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