湯俊照

摘要：研究miR-30d抑制喉癌細胞株人喉癌表皮細胞（Hep-2）的發(fā)展和耐藥性的作用機制。方法收取手術(shù)后的患者樣本，液氮法保存新鮮喉癌組織和正常喉組織，實時定量熒光PCR法檢測喉癌組織和正常組織中miR-30d的表達量。在Hep-2細胞系中采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染miR-30d寡聚核苷酸、miR-NC無義序列以及BECN1質(zhì)粒，生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-30d潛在靶點，雙熒光素酶報告基因法驗證miR-30d的靶點，Western blot技術(shù)檢測蛋白表達量，CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果喉癌組織組織與正常組織相比miR-30d表達量明顯降低，并隨著世界衛(wèi)生組織規(guī)定（WHO）的臨床分期級數(shù)增加而更加明顯。轉(zhuǎn)染miR-30d寡聚核苷酸序列后，miR-30d表達量較對照組明顯上調(diào)，并且轉(zhuǎn)染miR-30d后能明顯抑制人喉癌細胞的增殖、自噬水平和耐藥性。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)BECN1是miR-30d的潛在靶點，并且雙熒光素酶報告基因和Western blot進一步驗證了BECN1是其靶點。此外，過表達BECN1能夠逆轉(zhuǎn)miR-30d對Hep-2增殖、自噬水平和耐藥性的抑制作用。結(jié)論在喉癌組織中miR30d量表達明顯下調(diào)；miR-30d能夠抑制喉癌細胞Hep-2的增殖、自噬水平和耐藥性；BECN1是miR-30d的靶基因；過表達BECN1能逆轉(zhuǎn)miR-30d對喉癌細胞的影響；miR-30d是潛在的人喉癌細胞早期診斷和基因治療的候選靶點。

關(guān)鍵詞：MiR-30d；喉癌；自噬；BECN1

喉癌（LSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，目前治療喉癌的方式主要是手術(shù)和放療，雖然近20年來喉癌的臨床診斷和手術(shù)技術(shù)有了很大改進，但是由于喉癌臨床用藥的耐藥性致使喉癌預(yù)后仍不甚理想[1-3]。MicroRNA（miR）是一種長度為18～25nt的單鏈非編碼小分子RNA，miR的異常表達影響癌基因或者抑癌基因的表達從而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展和耐藥等過程[4， 5]。自噬是細胞中普遍存在的生理機制，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤的耐藥過程中起著重要的作用，目前許多研究表明miR能調(diào)節(jié)腫瘤自噬的水平來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6， 7]。BECN1 是形成自噬體的一個必需分子，它通過介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡，來調(diào)控哺乳動物自噬體的形成與成熟，并且其通過調(diào)節(jié)自噬活性來影響腫瘤[8-10]。miR-30d在多種腫瘤里呈低表達并表現(xiàn)為抑癌作用[11]，本研究探討miR-30d對喉癌細胞株人喉癌表皮細胞（Hep-2）細胞增殖、自噬水平和耐藥性的影響，并發(fā)掘其作用靶點，探究miR-30d抑制喉癌的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人喉癌細胞系Hep-2來源于美國ATCC細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）購自Clark公司。OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基、胰酶和EDTA購自Gbico。miR-NC mimics、miR-30d mimics購自銳博生物有限公司。BECN1質(zhì)粒購自addgene公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Annexin V FITC凋亡檢測試劑盒和TRIzol購自Invitrogen公司。CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。5-氟尿嘧啶（ 5-fluorouracil，5-FU）購自sigma公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Dimer EraserTM和Taq DNA 聚合酶購自TakaRa公司。TransStartFastPfu DNA Polymerase試劑盒購自北京全式金公司。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒購自Promega公司。RIPA細胞裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天公司。PVDF膜購自whatman公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Pierce公司。BECN1抗體和LC3抗體購自Sigma公司。GAPDH抗體購自Bioworld公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細胞按照推薦的培養(yǎng)方法，將細胞接種到六孔板。轉(zhuǎn)染前細胞內(nèi)加無血清細胞培養(yǎng)液，將所要轉(zhuǎn)染的mimics或者質(zhì)粒加入OPTI-MEM中輕輕混勻，同時將Lipofectamine 2000加入另一管OPTI-MEM中輕輕混勻，靜置5min后，將上述兩種溶液混合，室溫孵育30min后吸去六孔板中的培養(yǎng)液，將上述混合液加入培養(yǎng)皿，隨后輕輕混勻，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～6h后，吸除培養(yǎng)液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖檢測 將轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞消化，將細胞傳代至96孔板，每隔24h檢測細胞活性。用PBS十倍稀釋CCK-8溶液，吸盡培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，每孔加入1混勻的CCK-8稀釋液。另取一孔加入CCK-8稀釋液作為空白對照。將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h后用酶標(biāo)儀測定吸光度讀值，波長設(shè)為450nm。

1.2.3 Real-time PCR 方法檢測 Hep-2轉(zhuǎn)染48h后加入足夠的冷的PBS于在培養(yǎng)皿中，充分洗滌細胞，棄去PBS，重復(fù)以上操作2～3次。Trizol法提取RNA，測定濃度進行定量反轉(zhuǎn)成cDNA。采用SYBR法進行Real-time PCR檢測，采用2-△△Ct法分析實驗結(jié)果。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染24h加入20μg /ml 5-氟尿嘧啶處理48h后消化并經(jīng)PBS洗后收集細胞，1500r/min 離心5min，加入凋亡染料后送流式細胞檢測。

1.2.5Western blot檢測 細胞轉(zhuǎn)染后48h將細胞消化后加入裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度制備1μg /ml的蛋白樣品，20μl上樣于質(zhì)量分數(shù)為10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)于甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）并用5%的脫脂奶粉室溫封閉2～3h，一抗4℃過夜，PBST洗滌3次后二抗孵育2～3h，PBST洗滌三次后使用ECL顯影，凝膠成像儀成像。

1.2.6熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建和檢測 設(shè)計熒光素酶報告基因質(zhì)粒的引物為，用高保真酶FastPfu DNA Polymerase 進行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、酶切、連接后轉(zhuǎn)化進行菌落

鑒定和質(zhì)粒提取，最后測序進行驗證后得到目的質(zhì)粒。將Hep-2細胞接種至24孔板，每孔8×104個細胞，將miR-30d mimics、miR-NC mimics、報告基因質(zhì)粒和PGL4.74質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，24h后使用Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒分析檢測。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)過至少3次獨立實驗取平均值進行分析，并進行t檢驗，采用方差分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-30d在喉癌組織中低表達 使用實時熒光定量PCR法對38例喉癌組織和19例正常喉組織中miR-30d的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常喉組織相比喉癌組織中miR-30d表達量明顯下調(diào)（圖1 A， P<0.05）。并且按照WHO臨床分級標(biāo)準(zhǔn)對喉癌組織進行分級，發(fā)現(xiàn)隨著臨床分級水平提高miR-30d表達量下調(diào)越明顯（圖1 B， P<0.05）。

2.2miR-30d抑制喉癌細胞的增殖和自噬水平 將喉癌細胞株Hep-2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染miR-30d mimics和miR-NC mimics，實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)miR-30d表達量明顯上調(diào)（圖2 A， P<0.05）。將轉(zhuǎn)染后的細胞消化接種至96孔板通過CCK-8檢測增殖能力，發(fā)現(xiàn)miR-30d轉(zhuǎn)染后明顯抑制喉癌細胞的增殖能力（圖2B， P<0.05）。同時對轉(zhuǎn)染的細胞進行加5-Fu處理，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miR-30d能夠促進細胞凋亡從而增加喉癌細胞的化療敏感性（圖2 C， P<0.05）。并且通過Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)miR-30d能抑制喉癌細胞的自噬水平，這提示miR-30d對喉癌細胞的抑制作用是通過其抑制其自噬水平來發(fā)揮作用的（圖2 D）。

2.3miR-30d靶向抑制自噬相關(guān)蛋白BECN1的表達 通過生物信息學(xué)網(wǎng)站TatgetScan網(wǎng)站預(yù)測miR-30d能夠靶向BECN13'UTR區(qū)域（圖3 A），并且通過熒光素酶報告基因法驗證miR-30d能夠靶向抑制BECN1表達（圖3 B，P<0.05）。同時Western Blot結(jié)果也表明在喉癌細胞系Hep-2中過表達miR-30d可明顯下調(diào)BECN1的表達量（圖3 C）。

2.4過表達BECN1能夠逆轉(zhuǎn)miR-30d對喉癌細胞的抑制作用 在喉癌細胞系中分別轉(zhuǎn)染miR-30d mimics，miR-NC mimics，miR-30d mimics+BECN1，通過Western Blot進行檢測，發(fā)現(xiàn)喉癌細胞中過表達BECN1能逆轉(zhuǎn)miR-30d對BECN1靶向抑制作用并且能夠逆轉(zhuǎn)miR-30d對喉癌細胞自噬的抑制作用（圖4 A）。同時將上述轉(zhuǎn)染的細胞分別用CCK-8法檢測細胞增殖以及用流式細胞法檢測藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)過表達BECN1均能顯著逆轉(zhuǎn)miR-30d對喉癌細胞的抑制作用（圖4 B、C，P<0.05）。

3 討論

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤之一，在我國呈現(xiàn)一定區(qū)域性，臨床治療方法主要以手術(shù)為主化療為輔，目前五年生存率仍然很低，需要發(fā)展更有效的治療方案[12]。喉癌發(fā)病機制本質(zhì)上是多基因異常表達，通過原癌基因的過表達，喉癌細胞異常增生和侵襲，并且對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[13， 14]。miR是近年來腫瘤研究領(lǐng)域較為熱門的非編碼RNA，它常通過靶向癌基因或者抑癌基因來調(diào)節(jié)癌細胞的發(fā)生發(fā)展，目前眾多研究表明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miR的異常表達有很大關(guān)聯(lián)[15]。

自噬是細胞一種自我保護的機制，在腫瘤發(fā)生初期，自噬常表現(xiàn)為抑制腫瘤產(chǎn)生的作用，而當(dāng)腫瘤形成后，腫瘤細胞中的自噬則表現(xiàn)為對其的保護作用，幫助腫瘤細胞抵御外界不良因素，表現(xiàn)為促進腫瘤增殖、增加藥物耐受性等[16-18]。目前已有許多研究表明miR能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的自噬水平來調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤細胞中miR的異常表達導(dǎo)致腫瘤細胞自噬水平的紊亂，從而調(diào)控腫瘤的生物學(xué)功能[19-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在喉癌組織中明顯下調(diào)并且能通過靶向抑制自噬相關(guān)蛋白BECN1的表達來調(diào)節(jié)喉癌細胞的自噬水平從而抑制喉癌細胞的增殖和藥物耐受性，過表達BECN1能夠逆轉(zhuǎn)這一過程。本研究部分揭示了miR-30d抑制喉癌細胞的部分機制，這為miR-30d成為臨床早期診斷標(biāo)記和研發(fā)治療喉癌的分子靶向藥物提供較好的提示作用。然而喉癌細胞的發(fā)生、發(fā)展機制是一個較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，未來仍然有許多問題需要我們?nèi)ヌ接憽?/p>

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