但 剛，劉晨霞 綜述，吳麗娟審校

（成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實驗醫(yī)學研究與保障中心檢驗科，四川 成都 610083）

T淋巴細胞功能及檢測方法＊

但 剛，劉晨霞 綜述，吳麗娟△審校

（成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實驗醫(yī)學研究與保障中心檢驗科，四川 成都 610083）

T淋巴細胞； 免疫； 分化； 功能檢測

經(jīng)典免疫反應中T淋巴細胞是參與機體細胞免疫反應，并在免疫應答中起重要調節(jié)作用的免疫細胞。正常情況下T細胞及其亞群的數(shù)目在周圍組織中相對穩(wěn)定，但機體免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，各類免疫細胞尤其是T淋巴細胞的數(shù)量比例及其功能也隨之發(fā)生相應的變化。因此通過對T淋巴細胞功能的認識，檢測其數(shù)量比例，進行功能試驗的檢測，可以為機體的免疫狀態(tài)進行評估。本文就T淋巴細胞的功能及檢測方法作一綜述。T淋巴細胞簡稱T細胞，來源于骨髓的淋巴樣前祖細胞。在人體胚胎期和初生時期，部分多能干細胞或前T細胞從骨髓遷移到胸腺內，在胸腺激素的作用下誘導發(fā)育分化成熟，最終發(fā)育成為有免疫活性的T細胞，與B細胞、NK細胞等免疫細胞共同參與了人體的免疫應答。

1 T淋巴細胞亞群及其功能

T淋巴細胞依據(jù)因其CD3分子以外的其他表而標記物，以及生物學功能不同，而分為許多亞群，各亞群T細胞既相互協(xié)作，又有各自的功能特點，共同完成免疫應答并發(fā)揮免疫調節(jié)功能。

1.1 TCRαβ＋T細胞和TCRγδ＋T細胞 T細胞表面具有許多重要的膜分子，是區(qū)分T細胞及T細胞亞群的重要標志。T細胞抗原受體（TCR）為所有T細胞均表達的特征性標志，與CD3分子結合，形成TCR－CD3復合物。TCR有α、β、γ、δ四種類型的肽鏈，根據(jù)表達類型的不同，T細胞可分為TCRαβ＋T細胞和TCRγδ＋T細胞。兩者主要區(qū)別在于：前者具有TCR多樣性，具有自身MHC限制性；后者識別非肽類分子，其抗原受體缺乏多樣性，僅能識別多種病原體表達的共同抗原成分。兩者殺傷機制相同，活化后通過分泌細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用和介導炎癥反應。

1.2 Th、CTL和Tr細胞 根據(jù)免疫效應功能，T淋巴細胞可分為：輔助性T淋巴細胞（Th）、細胞毒性T淋巴細胞（Tc或CTL）、調節(jié)性T淋巴細胞（Tr）。這些細胞實際上是初始CD4＋T細胞或初始CD8＋T細胞活化后分化成的效應T淋巴細胞。

1.2.1 輔助性T細胞 該細胞為CD4＋T細胞，識別抗原時受MHC－Ⅱ類分子限制，根據(jù)分泌的細胞因子不同分為Th0、Th1、Th2和Th3四個亞型［1］，發(fā)揮不同的免疫效應。

1.2.2 Th1細胞 Th1細胞在機體中抗胞內病原體感染發(fā)揮重要作用，主要介導細胞毒及局部炎癥相關的免疫應答，輔助抗體生成以參與細胞免疫和遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生。其分泌白細胞介素（IL）－2、干擾素（IFN）－α、IFN－γ、TNF－δ等。

1.2.3 Th2細胞 主要參與機體的體液免疫，刺激B細胞增殖，生成免疫球蛋白IgG1和IgE抗體。其主要分泌IL－4、IL－5、IL－6和IL－10。

1.2.4 Th3細胞 主要作用為通過降低抗原遞呈細胞（APC）和Th1細胞的活性，起到免疫抑制的作用。其主要分泌IL－4和IL－10外，還大量表達TGF－δ，但不會分泌IL－2和IFN－γ。

1.2.5 細胞分化 Th0細胞又稱前體細胞，主要分化為Th1，Th2和Th3細胞。未接觸抗原的T細胞被稱為Th細胞前體。細胞前體通過接觸天然免疫細胞攝取的抗原，進而分化成一種不確定的狀態(tài)稱為Th0細胞。Th0細胞同時分泌Th1型細胞因子IL－2和IFN－γ，而且分泌Th2型細胞因子IL－4，并且可在不同信號的刺激下分別分化為Th1或Th2細胞。當機體生理功能正常時，為了維持機體主要的細胞免疫和體液免疫功能，Th1和Th2細胞相互間處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)；而當機體受到外來刺激或某種抗原攻擊時，Th1細胞主導的細胞免疫應答功能和Th2細胞主導的體液免疫功能選擇性增強，而另一功能則選擇性降低，這種現(xiàn)象稱為Th1/Th2漂移。在微環(huán)境中，細胞因子的種類是影響Th細胞分化的關鍵因素。通常認為，在抗原的刺激下，由于不同的內部微環(huán)境影響，Th0細胞會選擇性地分化為Th1或Th2細胞。

1.2.6 細胞毒性T細胞 該細胞為CD8＋T細胞，具有細胞毒作用，可殺傷病毒等細胞內寄生物感染的靶細胞；也具有免疫調節(jié)作用。該類細胞識別抗原具有MHC－Ⅰ類分子的限制性；殺傷靶細胞具有抗原特異性等作用特點。CTL殺傷靶抗原的機制為：（1）表達Fas配體（FasL）與靶抗原（包括被感染細胞和癌細胞等）表而Fas分子交聯(lián)，激發(fā)其凋亡的發(fā)生；（2）分泌穿孔素溶解靶細胞膜；（3）分泌細胞因子如IFN－γ、TNF－α和TNF－β等，抑制或破壞靶抗原DNA合成。CD8＋T淋巴細胞是旱期抗感染和抗腫瘤最主要的免疫細胞［2］。

1.2.7 調節(jié)性T細胞 Tr細胞亞群主要通過抑制性調節(jié)CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的活化與增值，達到免疫負調節(jié)的作用。

2 T淋巴細胞的相關試驗

2.1 T淋巴細胞數(shù)量檢測 臨床上各種類型的免疫缺陷癥、自身免疫疾病以及腫瘤等疾病均可表現(xiàn)出淋巴細胞的數(shù)量比例的變化，因此檢測外周淋巴細胞的數(shù)量、比例，有助于判斷機體細胞水平，對疾病的認識發(fā)展，對患者病情的變化，對臨床診療的指導均有十分重要的意義。目前T淋巴細胞數(shù)量檢測主要有以下方法：（1）免疫熒光法，通過直接或間接檢測T細胞標志物，確定T細胞亞群及比例。如CD3＋、CD4＋、CD8＋、免疫球蛋白等。（2）磁珠分離法，可利用已知抗細胞表面標記的抗體交聯(lián)于微珠，與細胞懸液反應，磁珠借助抗體結合于相應的細胞表面，將懸液傾入試管并置于磁場中，結合磁珠的細胞最終與未結合磁珠的細胞分離，即可得到高純度的含有已知細胞表面標記物的細胞群或亞群。如采用抗CD3特異性抗體IMB，即可分離T淋巴細胞。（3）淘選法，將已知抗細胞表面標記的抗體包被培養(yǎng)皿，加入淋巴細胞懸液，表達該細胞表面標記的細胞貼附于固相上，與其他細胞分離。（4）流式細胞術，流式細胞術是借助熒光激活細胞分選器，對細胞進行快速而準確鑒定、分類的技術。流式技術常常用于T淋巴細胞功能檢測。Ahn等［3］利用流式細胞內因子染色技術，檢測結合人乳頭瘤病毒E7亞單位瘤苗和重組腺病毒AdIL－12使用時，所引起的CTL反應強度。Suzuki等［4］使用流式細胞胞內細胞因子分析法，鑒定了結核分枝桿菌保護性抗原的CTL表位。

2.2 T淋巴細胞的功能檢測 機體免疫系統(tǒng)具有免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視功能。免疫細胞是主要的參與者，因此針對其功能設計的檢測技術，往往比單獨測定淋巴細胞或其亞群的數(shù)量更能反映免疫細胞的功能及機體免疫功能的狀態(tài)。故通常采用以下技術評價T細胞的功能。

2.2.1 T細胞增殖試驗 在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，特定抗原（結核菌素）或非特定的有絲分裂原，如植物血凝素（PHA）、豆刀蛋白A（Con A）會刺激淋巴細胞代謝和形態(tài)變化，導致細胞內蛋白質和核酸和成增加，從而致使T細胞發(fā)生一系列增殖反應。檢測方法主要為以下幾種。（1）形態(tài)學方法。T細胞增殖反應，形態(tài)學上主要表現(xiàn)為：細胞變大，胞質增多、胞質出現(xiàn)空泡、核染色質疏松、核仁明顯，轉化為淋巴母細胞。借助光學顯微鏡鏡檢，計數(shù)200個細胞，按以上形態(tài)變化特點為依據(jù)分類計數(shù)，計算淋巴細胞轉化率，在一定程度上評價細胞免疫功能。該方法簡單、成本低、適合基層實驗室開展，但主觀性較強，易受實驗人員的專業(yè)素質、能力經(jīng)驗等影響。（2）放射性核素摻入法：在淋巴細胞與絲裂原共同培養(yǎng)終止前，加入放射性核素3H－TdR，其被轉化的淋巴細胞攝取而摻入新合成的DNA中。用液體閃爍儀測定放射性核素量，記錄每分鐘的脈沖數(shù)（cpm），計算刺激指數(shù)（SI），判斷淋巴細胞轉化程度。該方法優(yōu)于形態(tài)學檢查，避免了主觀因素影響，但有放射性危害缺點［5］。（3）MTT法：其原理為活細胞線粒體含有琉拍酸脫氫酶，能使加入的MTT還原為難溶性的結晶物formazan并沉積在細胞中。依據(jù)此原理，將淋巴細胞與絲裂原共同培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后加入MTT，再加入SDS裂解液，溶解細胞中的結晶物甲瓚，結晶物呈紫色，利用比色儀在570nm波長測定其吸光度［6－7］?；罴毎麛?shù)與MTT結晶物形成的量成正相關，增殖生長旺盛的細胞產(chǎn)生的MTT更多，其吸光度更高，反之，則吸光度則更低［8］。MTT法排除形態(tài)觀察法的主觀差異性，避免同位素摻人法的不穩(wěn)定性和放射性污染，具有大量樣本快速檢測的優(yōu)點，故更適于T淋巴細胞的增殖功能和免疫功能評價［9－11］。

2.2.2 T細胞介導的細胞毒試驗 CTL經(jīng)抗原刺激，可特異性殺傷相應的靶細胞，主要通過細胞裂解和細胞凋亡兩種機制，對靶細胞表現(xiàn)出破壞和溶解作用，可用以下方法評價CTL殺傷活性：（1）形態(tài)學方法，待檢CTL與靶細胞混合培養(yǎng)，瑞士染色后鏡檢，計數(shù)殘余腫瘤細胞數(shù)，計算CTL細胞對腫瘤細胞生長的抑制率。該法的優(yōu)點是操作簡便易行，一般實驗室即可開展，缺點是受人員主觀影響大。（2）51Cr釋放法，51Cr釋放法創(chuàng)建于1960年，是測定CTL功能經(jīng)典方法，是評價抗原特異性CTL反應的金標準。該法用51Cr標記的靶細胞與效應性CTL相互作用，靶細胞可釋放51Cro，測定51Cro產(chǎn)生的放射性，即可判定效應細胞CTL的細胞毒活性。用相同的方法也可測定NK細胞的細胞毒活性。此方法結果準確、重復性好。但同時存在以下不足：51Cr半衰期短，只有27.8d，不能進行多次測定；51Cr釋放法為定性分析；不能在單細胞水平測定；由于從外周血中直接采取得到的效應細胞很少，需進行多次體外刺激，取得效應細胞，故而可能會導致T細胞的組成及活性與體內狀態(tài)不同［12－13］。（3）LDH釋放法，在細胞培養(yǎng)中，細胞死亡數(shù)目與細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性成正比，所以，測定實驗孔上清液中LDH活性，并與靶細胞對照孔中LDH活性進行比較，即可計算出效應細胞對靶細胞的殺傷百分率［13］。LDH釋放法的優(yōu)點是無需預標靶細胞，能夠避免同位素摻入法的不穩(wěn)定性和放射性污染。同時排除了細胞形態(tài)觀察法的人為主觀差異，能夠進行大樣本快速檢測。LDH釋放法的缺點是效應細胞作用于靶細胞后會有不同程度的細胞損傷，進而釋放LDH，LDH可能存在部分自發(fā)釋放現(xiàn)象，都會影響到細胞活性毒性檢測。（4）基因轉染法，將具生物功能的核酸轉移或運送到細胞內，并使核酸維持其生物功能。利用其技術，將熒光素酶（luc）或β半乳糖普酶（β－gal）之類的報告酶基因轉染靶細胞，建立轉染靶細胞系，測定CTL介導的細胞毒。通過測定釋放入培養(yǎng)液中的報告酶的活性，即計算出效應細胞殺傷靶細胞的百分率。在實驗中，β－gal因半衰期較長而實際應用較多［14］。

2.2.3 T細胞分泌功能檢測 T淋巴細胞活化后，能夠分泌如IL－2、IFN－γ、TNF－α等具有功能的細胞因子。根據(jù)細胞因子不同，可以區(qū)分出不同功能的細胞，如記憶細胞或效應細胞。常用的檢測細胞分泌功能的方法有酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、固相酶聯(lián)斑點法（ELISPOT）、PCR/RT、PCR及細胞內因子檢測方法等。

2.3 免疫學檢測

2.3.1 ELISA ELISA是利用抗原與抗體的特異反應來進行定量檢測的方法。ELISA法可直接檢測細胞因子（如IL－2、IFN－γ或TNF－α）水平，也可用于測定激活的淋巴細胞（諸如LAK或CIK細胞）培養(yǎng)液中各細胞因子水平。ELISA法檢測的是細胞因子的總量，無法檢測出單一細胞的信息，也不能準確估算抗原特異性T淋巴細胞的數(shù)量，而且，它不能檢測被抗原刺激后上的淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的能力［15］。

2.3.2 ELISPOT ELISPOT技術是基于酶聯(lián)免疫標記技術的原理建立的。CTL細胞受抗原刺激后分泌具有功能的細胞因子，即可被預包埋的抗體捕獲，在局部形成斑點數(shù)目，通過檢測斑點數(shù)，即可得出T淋巴細胞頻數(shù)，進而反映出CTL的活性。此方法具有較高的靈敏度。Bilhl等［14］使用循環(huán)ELLSPOT技術，用少量外周血標本，檢測了HIV病毒、巨細胞病毒、EB病毒、HBV病毒及HCV病毒等5種病毒的近400個CTL表位所引起的抗病毒免疫，結果顯示與普通ELLSPOT檢測相比差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此技術可用于評價多重病毒感染所引起的細胞免疫［16］。ELISPOT的優(yōu)點在于：敏感性很高；特異性很強；且可直接檢測T淋巴細胞；能反復檢測多種細胞因子；同時反映其功能，與臨床結果具有較好的相關性。ELISPOT法缺點：所檢測的T淋巴細胞必須分泌目標細胞因子，如果不能分泌目標細胞因子，就有可能導致特異性細胞的數(shù)量測定的降低。除了CTL外，（CD3＋和CD4＋）、NK細胞等一些輔助T淋巴細胞也能分泌類似的細胞因子，故還需結合細胞表型進行分析［17］。

2.3.3 染色細胞內的細胞因子 此法是檢測人循環(huán)淋巴細胞中抗原特異性T淋巴細胞的可行方法。先在體外培養(yǎng)、刺激、活化細胞，使用Brefeldin A封閉細胞因子的分泌，使其在細胞內累積。使用生物素或熒光標記的CD4＋或CD8＋的mAb對細胞進行標志物染色，再經(jīng)去污劑固定，同時增高細胞通透性，最終使抗細胞因子熒光抗體結合到細胞內從而達到染色的目的。這種方法應用細胞內累積細胞因子進行染色［18］。

2.3.4 生物活性檢測 根據(jù)細胞因子的獨特生物學活性，選用相應的實驗體系，包括細胞增殖法、直接殺傷法、保護細胞免受病毒致病變法等。要求選用的細胞株增殖反應水平與細胞因子濃度成正相關，如IL－1、IL－2、IL－4及IL－6水平等。

2.3.5 基因水平的檢測 通過PCR、RT－PCR或熒光定量PCR方法，可對細胞因子的DNA或RNA進行檢測。它可以檢測一種或多種目標基因轉錄水平，是一種較準確的分子生物學方法。有學者曾用熒光定量RT－PCR法分析了冷凍保存的健康人血標本中的細胞因子mRNA水平［19］。該法同時作為檢測免疫反應的指標應用于腫瘤免疫的臨床試驗中。熒光定量RT－PCR基本上不需要任何體外刺激步驟，即可準確檢測抗原特異性T淋巴細胞的數(shù)目，是目前最敏感的細胞因子檢測技術［11，20］。

3 小結與展望

淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞在機體免疫應答中發(fā)揮著重要的作用。通過深入研究分析T淋巴細胞的功能，可以充分認識免疫應答的相應環(huán)節(jié)，進一步研究機體免疫反應有著重要意義。各種功能試驗的認識，能直觀有效的評價機體的免疫狀態(tài)，了解患者病情的發(fā)生發(fā)展，指導臨床診斷治療，評價臨床療效。另外，掌握各個功能試驗的原理，舉一反三，有利于不斷的改進優(yōu)化。

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10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.039

A

1673－4130（2015）03－0377－04

2014－10－01）

成都軍區(qū)總醫(yī)院院管課題（42412E1A）。 作者簡介：但剛，主管技師，主要從事臨床血液學檢驗的研究?！?/p>

，E－mail：wulijuan1638＠126.com。