沈天行，宋建新

（1.云縣人們醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 臨滄 675800；2.云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

標(biāo)本放置溫度和時(shí)間對T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志檢測結(jié)果的影響

沈天行1，宋建新2△

（1.云縣人們醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 臨滄 675800；2.云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

目的探討標(biāo)本放置溫度和時(shí)間對流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志結(jié)果的影響。方法采集健康體檢者血液，EDTA－K2－抗凝，室溫及4℃保存，在不同時(shí)間進(jìn)行CD3＋T淋巴細(xì)胞CD69、CD25、HLA－DR檢測。結(jié)果EDTA－K2－抗凝血室溫保存標(biāo)本與新鮮標(biāo)本相比，CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋細(xì)胞百分率在12h開始減低，CD3＋CD69＋到16h明顯減低（P＜0.05），CD3＋CD25放置到20h時(shí)明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)逐漸增高，到20h時(shí)明顯增高（P＜0.05）；4℃放置的標(biāo)本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋到24h時(shí)明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)到24h變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論作為T淋巴細(xì)胞的活化標(biāo)志，室溫放置標(biāo)本檢測CD3＋CD69＋應(yīng)在12h內(nèi)完成，CD3＋CD25＋應(yīng)在16h內(nèi)檢測，CD3＋HLA－DR＋可在20h內(nèi)檢測，最好放置4℃保存標(biāo)本。

T淋巴細(xì)胞； 活化標(biāo)志； 溫度； 時(shí)間

CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DA＋T淋巴細(xì)胞是一類已活化的免疫細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起著重要的作用［1］。目前應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞活化水平已廣泛應(yīng)用于許多疾病特別是自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的研究及療效觀察［2－3］，其準(zhǔn)確性直接影響臨床診斷及療效觀察。目前對外周血本放置時(shí)間對T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的影響已有報(bào)道［4］，而對其活化標(biāo)志的影響研究鮮見報(bào)道。本文對這一影響因素進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年4月本院健康體檢者10例的標(biāo)本，其中男5例，女5例，平均年齡34歲。

1.2 儀器于試劑 Beckman Coulter公司FC500型流式細(xì)胞儀，熒光標(biāo)準(zhǔn)微球Flow－Check、CD45－FITC、CD3－PE－Cy5、CD69－PE、CD25－PE、HLA－DR－PE及同型對照均購自Immunotech公司。

1.3 方法 空腹采集健康體檢者靜脈血于EDTA－K2－抗凝管各2.0mL，充分混勻，室溫（20±5）℃及4℃冰箱保存。分別于采血后0、2、4、8、12、16、20、24h按常規(guī)方法用CD45－FITC/CD3－PE－Cy5/CD69－PE或CD25－PE、HLA－DR－PE標(biāo)記并設(shè)同型對照；用熒光標(biāo)準(zhǔn)微球Flow－Check校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀的光路和流路，用同型對照設(shè)定陽性域值后檢測，每份樣本均檢測并分析10 000個(gè)細(xì)胞，記錄各抗原表達(dá)的百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各抗原表達(dá)的百分率以表示，組間比較常用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

EDTA－K2－抗凝室溫保存不同時(shí)間CD69、CD25、HLA－DR表達(dá)見表1。與0h相比，CD3＋CD69＋細(xì)胞表達(dá)百分率在12h開始減低，到16h明顯減低（t＝2.57，P＜0.05），CD3＋CD25＋到20h明顯減低（t＝3.18，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)逐漸增高，到20h時(shí)明顯增高（t＝2.87，P＜0.05）。4℃保存不同時(shí)間CD69、CD25、HLA－DR表達(dá)見表2。與0h相比，4℃放置的標(biāo)本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表達(dá)到24h時(shí)明顯減低（t＝3.47，t＝3.25，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)到24h的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.27，P＞0.05）。

表1 室溫保存不同時(shí)間CD69、CD25、HLA－DR表達(dá)（，%）

＊P＜0.05，與0h比較。

保存時(shí)間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DR＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.75±0.26 3.39±0.58 4.88±0.94 4h 0.79±0.25 3.46±0.52 4.86±0.94 8h 0.79±0.24 3.47±0.54 4.87±0.95 12h 0.63±0.21 3.32±0.52 4.94±0.94 16h 0.47±0.17＊3.05±0.53 5.31±0.98 20h 0.31±0.16 2.68±0.51＊6.04±0.94＊24h 0.21±0.05 2.04±0.39 5.23±0.51

表2 4℃保存不同時(shí)間CD69、CD25、HLA－DR表達(dá)（，%）

保存時(shí)間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.76±0.27 3.41±0.55 4.83±0.96 4h 0.77±0.26 3.43±0.56 4.85±0.93 8h 0.79±0.26 3.45±0.55 4.84±0.94 12h 0.73±0.25 3.45±0.56 4.89±0.97 16h 0.69±0.26 3.40±0.57 4.88±0.96

續(xù)表2 4℃保存不同時(shí)間CD69、CD25、HLA－DR表達(dá)（，%）

＊：P＜0.05，與0h比較。

保存時(shí)間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋20h 0.62±0.21 3.21±0.48 4.91±0.93 24h 0.48±0.17＊2.92±0.31＊4.95±0.98

3 討 論

CD69被稱為活化誘導(dǎo)分子（AIM），早期活化抗原－1（EA－1）等，是C－型凝集素受體家族的成員。CD69是T淋巴細(xì)胞活化后最早表達(dá)的表面抗原，當(dāng)其表達(dá)后，可作為共刺激信號促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖［5］。

CD25是IL－2R的α鏈，又稱IL－2Rα分子或Tac抗原，為細(xì)胞因子受體。它是T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)相對較早的標(biāo)記，是活化細(xì)胞具有的抗原，在與β、γ亞基結(jié)合后形成具有高親和力的IL－2R，IL－2R與IL－2結(jié)合后T細(xì)胞進(jìn)入S期，完成克隆增殖。

HLA－DR是MHC－1Ⅰ類分子，具有高度多肽性，在調(diào)控抗原遞呈細(xì)胞激活T細(xì)胞活化程度和特異性中起重要作用，是T細(xì)胞活化晚期表達(dá)抗原［1］。

CD3是T淋巴細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記分子，分析CD3＋T淋巴細(xì)胞中CD69、CD25、HLA－DA表達(dá)率目前已廣泛應(yīng)用于許多疾病特別是自身免疫性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Graves病）發(fā)病機(jī)制的研究、疾病的活動(dòng)情況及療效的觀察等［6－8］。目前檢測CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，對標(biāo)本處理要求嚴(yán)格，因此本文探討標(biāo)本放置溫度和時(shí)間對檢測結(jié)果是否會(huì)有影響。

本組測定結(jié)果顯示，EDTA－K2－抗凝的外周血在室溫放置的情況下，CD3＋CD69＋細(xì)胞表達(dá)百分率在12h開始減低，到16h時(shí)明顯減低（P＜0.05）；CD3＋CD25＋到20h時(shí)明顯減低（P＜0.05）；CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)逐漸增高，到20h時(shí)明顯增高（P＜0.05）。故建議，室溫放置的標(biāo)本，對于CD3＋CD69＋的檢測應(yīng)在12h內(nèi)檢測，CD3＋CD25＋及CD3＋HLADR＋應(yīng)在16h內(nèi)檢測。

4℃保存放置的標(biāo)本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表達(dá)到24h時(shí)明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細(xì)胞表達(dá)到24h變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。故建議，4℃保存放置的標(biāo)本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋應(yīng)在20h內(nèi)檢測，CD3＋HLA－DR＋可在24h內(nèi)檢測。

綜上所述，為了減少EDTA－K2－抗凝標(biāo)本放置溫度和時(shí)間對CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋測定的影響，標(biāo)本最好放置4℃保存，并在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)測定，以消除由此引起的實(shí)驗(yàn)前誤差，為臨床提供更準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

［1］Rea IM，McNerlan SE，Alexander HD.CD69，CD25，and HLADR activation antigen expression on CD3＋lymphocytes and relationship to serum TNF－alpha，IFN－gamma，and sIL－2Rlevels in aging［J］.Exp Gerontol，1999，34（1）：79－93.

［2］ 趙永強(qiáng)，董中升，劉占舉.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血和關(guān)節(jié)滑液中T細(xì)胞CD25CD69表達(dá)及意義［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2007，28（3）：9－10.

［3］ 郭義龍，蔡翁義，蔡小丹，等.復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者外周血T細(xì)胞CD69和HLA－DR的表達(dá)［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2007，8（8）：667－669.

［4］ 汪鎏漪，宋建新.不同抗凝劑及標(biāo)本放置時(shí)間對T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，28（3）：138.

［5］汪慧英，James JL，Nancy AL.CD69的表達(dá)在小鼠嗜酸細(xì)胞的活化與凋亡中的作用［J］.中國病理生理雜志，2009，26（1）：1－6.

［6］章毅英，黃先玫，康曼麗，等.CD69和CD25及HLA－DR在川崎病患兒外周血T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的研究［J］.中華兒科雜志，2006，44（5）：329－332.

［7］馬晶波，李鋒，馮樹芳，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD4＋CD8＋和CD22＋淋巴細(xì)胞活化分子CD69的表達(dá)［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2003，7（2）：71－74.

［8］ 趙永強(qiáng)，董中升，劉占舉，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血和關(guān)節(jié)滑液中T細(xì)胞CD25CD69表達(dá)及意義［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2007，28（3）：9－10.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.063

B

1673－4130（2015）03－0420－02

2014－10－26）

△通訊作者，E－mail：songjianxin8＠126.com。