于 勇，畢良佳

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 口腔科，黑龍江 哈爾濱150081)

眾所周知，口腔內(nèi)存在著數(shù)百種細(xì)菌，它們在口腔疾病發(fā)生發(fā)展的過程中扮演著重要角色，例如伴發(fā)于潰瘍口瘡等黏膜疾病的感染，菌斑導(dǎo)致的牙齦炎牙周炎和厭氧菌引發(fā)的根管深部炎癥。針對口腔內(nèi)的致病菌，藥物治療是目前廣泛應(yīng)用的治療手段。

但在過去幾十年，致病菌對抗生素的耐藥性在公共健康領(lǐng)域已經(jīng)成為一個(gè)棘手的問題［1］，并且與分散的細(xì)菌相比，菌斑生物膜更加耐藥和難以被清除。研究表明菌斑復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，組成成分和可變的表面形態(tài)是其耐藥性的根源［2-3］。尤其重要的是菌斑的結(jié)構(gòu)，它決定了菌斑內(nèi)部物質(zhì)的運(yùn)輸過程，并形成具有特殊酸堿度和營養(yǎng)利用率的微環(huán)境［4］。因此，口腔的抗菌治療需要除藥物治療以外其它的非創(chuàng)傷抗菌療法。該療法要擁有比藥物更高的殺菌效率，可以局部應(yīng)用，更小的毒副作用，更重要的是不易產(chǎn)生耐藥性。經(jīng)過長時(shí)間的探索，以超聲為代表的聲學(xué)抗菌成為研究的方向之一。

1 超聲抗菌簡介

自從Harvey 等［5］在1929年第一次提供超聲能殺菌的證據(jù)之后，超聲就開始作為一種滅菌方法被研究。由Scherba 等［6］在1991年首先提出超聲的殺菌作用，實(shí)驗(yàn)顯示浮游態(tài)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌都被不同程度的殺滅，同時(shí)作者提出低頻率超聲殺菌的主要機(jī)制是空化效應(yīng)。1994年，Pitt 等［7］提出超聲聯(lián)合抗生素的殺菌效果勝過單純抗生素。1997年，O’Leary 等［8］發(fā)表了少有的關(guān)于超聲對口腔細(xì)菌:伴放線桿菌和牙齦卟啉單胞菌的殺菌作用，它們是人類牙周疾病的主要致病菌。研究顯示超聲清創(chuàng)術(shù)和超聲刮治術(shù)(頻率＜25 kHz)在活體內(nèi)消滅了菌斑生物膜。

由于抗菌實(shí)驗(yàn)中超聲的參數(shù)眾多，為了便于對研究結(jié)果的橫向比較，多數(shù)學(xué)者將治療性超聲依據(jù)強(qiáng)度劃分為低強(qiáng)度(＜3 W/cm2)和高強(qiáng)度(＞5 W/cm2)超聲，依據(jù)頻率又分為低頻(＜500 kHz)和高頻(＞500 kHz)超聲［9］。

空化效應(yīng)被認(rèn)為是超聲殺菌的主要機(jī)制。該效應(yīng)的作用原理可以理解為入射聲波的高低聲壓周期引起液體中微泡的擴(kuò)大和縮小，細(xì)菌因此受到微泡周邊剪切力的作用。微泡破碎所產(chǎn)生的高溫又可將水和其它分子變成自由基，從而產(chǎn)生殺菌物質(zhì)如過氧化氫。

此外經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲能促進(jìn)藥物在菌斑中的滲透，促滲作用是超聲聯(lián)合抗生素時(shí)提高抗生素殺菌效果的主要機(jī)制［10］。

2 超聲抗菌新進(jìn)展

由于空化效應(yīng)是超聲殺菌的主要機(jī)制，學(xué)者大多針對空化效應(yīng)展開探索，此外，在低頻超聲促滲效應(yīng)等其他方面也有報(bào)道。

2.1 超聲的空化效應(yīng)

在超聲靶向破壞微泡(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)增強(qiáng)萬古霉素對表皮葡萄球菌膜殺傷效果的研究中，經(jīng)超聲(80 kHz，1.0 W/cm2)作用10 min 菌膜即產(chǎn)生了微孔。菌膜密度和活菌計(jì)數(shù)相比對照組有明顯降低［11］。同樣在超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對抗表皮葡萄球菌生物膜的實(shí)驗(yàn)中，超聲(300 kHz，0.5 W/cm2)增強(qiáng)了生物膜對萬古霉素的敏感性，單純的微泡即能對生物膜產(chǎn)生破孔作用。根據(jù)以上研究，UTMD 增強(qiáng)了生物膜的通透性，從而使抗生素的殺菌效果明顯提高［12］。

類似的微氣泡介導(dǎo)超聲(microbubble-mediated ultrasound，MUS)同樣增強(qiáng)了慶大霉素殺傷大腸桿菌的效果，MUS 組活菌計(jì)數(shù)有顯著降低。單純超聲組和MUS 組慶大霉素的最小抑菌濃度顯著低于對照組和單純微泡組?？赡艿臋C(jī)制是空化作用增加了大腸桿菌細(xì)胞膜對慶大霉素的通透性［13］。

微泡破裂產(chǎn)生的力被認(rèn)為是超聲滅活微生物能力的來源。為了驗(yàn)證以上理論，Gao 等［14］分別用兩種細(xì)胞壁來抵抗應(yīng)力，并且由多種強(qiáng)度和作用時(shí)間的超聲產(chǎn)生不同的微泡數(shù)量。應(yīng)用20 kHz 的超聲作用于桿菌屬的產(chǎn)氣腸桿菌和酵母菌屬的短梗霉菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種微生物的數(shù)量都隨著超聲作用時(shí)間的增加呈線性減少，且死亡率與超聲強(qiáng)度正相關(guān)。同一課題組應(yīng)用低頻超聲(20 kHz)，作用于懸浮態(tài)的產(chǎn)氣腸桿菌和枯草桿菌產(chǎn)生了明顯的殺傷效果。并且發(fā)現(xiàn)超聲對于產(chǎn)氣腸桿菌在對數(shù)生長期的作用效果比穩(wěn)定期更顯著，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為細(xì)菌對于超聲滅活的抵抗力主要來源于莢膜的厚?。?5］。

Lentacker 等［16］指出，超聲和微泡加強(qiáng)了藥物的運(yùn)輸。微泡在細(xì)菌胞膜上可以產(chǎn)生臨時(shí)的孔洞，由此產(chǎn)生了聲孔效應(yīng)，增強(qiáng)了細(xì)菌胞體對藥物的內(nèi)吞作用。低強(qiáng)度的超聲產(chǎn)生穩(wěn)定的空化效應(yīng)，使細(xì)菌的內(nèi)吞作用得到活化。高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生微泡的破裂效應(yīng)，在細(xì)菌胞膜上形成孔洞，增強(qiáng)細(xì)菌對藥物的吸收。

2.2 超聲抗菌的其它效應(yīng)

低頻超聲對生物膜有促滲作用，多聯(lián)合藥物應(yīng)用。在對眼角膜的促滲試驗(yàn)中應(yīng)用強(qiáng)度0. 8 W/cm2，頻率400 kHz 和600 kHz 的超聲作用于眼角膜5 min。400 kHz 超聲組房水中的藥物量較對照組增加了2.8 倍，600 kHz 組增加了2.4 倍，雖然兩組頻率相近，但實(shí)驗(yàn)中低頻超聲較高頻超聲具有更強(qiáng)的促滲能力。增加了藥物透過角膜向眼內(nèi)滲入的量，該實(shí)驗(yàn)有效詮釋了低頻超聲對生物膜的促滲作用［17］。

在牙體牙髓治療領(lǐng)域，對于根管中的糞腸球菌生物膜，超聲聯(lián)合光動(dòng)力的治療顯著減少了菌量，超過99%的糞腸球菌被殺死。研究者認(rèn)為由于菌外基質(zhì)的存在光敏劑仍然難以進(jìn)入菌斑內(nèi)部，超聲除加強(qiáng)了光敏劑進(jìn)入菌膜的能力還進(jìn)一步活化光敏劑［18］。該實(shí)驗(yàn)也顯示出超聲可以增強(qiáng)細(xì)菌的內(nèi)吞作用和細(xì)胞膜的通透性。

在創(chuàng)口感染中，菌斑生物膜也扮演了關(guān)鍵角色。超聲輔助清創(chuàng)裝置(ultrasonic - assisted wound debridement device，UAW)能有效的破壞模擬創(chuàng)口感染的金黃色葡萄球菌半固態(tài)生物膜。并且在使用防腐消毒劑之前應(yīng)用UAW 更有利于減少細(xì)菌的數(shù)量［19］。

3 聲動(dòng)力療法

近幾年，在單純超聲抗菌的基礎(chǔ)上，聲動(dòng)力療法(sonodynamic therapy，SDT)從一種抗癌細(xì)胞的手段，逐漸被應(yīng)用到抗菌領(lǐng)域中。SDT 是一種依靠超聲激活聲敏劑，產(chǎn)生對細(xì)胞有毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)從而殺死細(xì)胞的方法［20］。目前應(yīng)用較多的聲敏劑多來自光敏劑［21］，如下文提到的血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)，可以被超聲和特定波長的光激發(fā)。因SDT 是一種有潛力的抗菌方法，學(xué)者們又將其稱為聲動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(sonoantimicrobial chemotherapy，SACT)。得益于超聲優(yōu)良的滲透效果，SACT 有望成為針對口腔深部感染，例如位于深牙周袋或者根管深部的病灶的有效治療手段［22］。

4 聲動(dòng)力抗菌新進(jìn)展

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA)是臨床難治性感染的重要原因。Wang 等［23］用頻率1 MHz 強(qiáng)度1.56 W/cm2的超聲作用MRSA 懸液5 min，姜黃素為聲敏劑。通過對菌落形成單位(colony forming units，CFUs)的計(jì)數(shù)評估細(xì)菌數(shù)量的多少。結(jié)果顯示超聲介導(dǎo)的姜黃素對MRSA 有明顯的殺傷效果。作者提出可能的機(jī)制是超聲致敏細(xì)菌從而促進(jìn)了姜黃素對細(xì)菌DNA 的破壞效果，同時(shí)增加了跨細(xì)胞膜的物質(zhì)輸送導(dǎo)致細(xì)菌的DNA 更易受到損傷。同一團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用相同參數(shù)超聲和聲敏劑對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)，乏氧組的細(xì)菌幸存率高于正常氧含量組，聲動(dòng)力的滅菌能力顯示出對氧環(huán)境的依賴。此印證了SACT 是通過超聲，聲敏劑和ROS 的聯(lián)合作用來達(dá)到殺菌目的，乏氧環(huán)境抑制了活性氧的產(chǎn)生從而降低SACT 的殺菌效率。此外該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為細(xì)菌的細(xì)胞壁也是影響殺菌效果的重要原因。革蘭陰性菌比革蘭陽性菌有更多的細(xì)胞外組織，因此更耐殺菌劑［24］。

口腔抗菌方面，Zhuang 等［25］在20 只大鼠的口腔內(nèi)人造牙周炎模型，以HMME 為聲敏劑，超聲(1 W/cm2，1 MHz)作用30 min 后，SDT 組的組織學(xué)評價(jià)比對照組顯示出更少的骨喪失。由此推斷HMME 介導(dǎo)的SDT 能有效減輕大鼠牙周炎引起的牙槽骨破壞。間接反映出SDT 對牙周炎病原菌的殺滅作用。此外該研究還反映出SDT 繼承了超聲良好的穿透性，體現(xiàn)出對一定深度組織內(nèi)的病灶的治療能力。同一團(tuán)隊(duì)還探究了HMME 介導(dǎo)的SACT對金黃色葡萄球菌的影響。在HMME 濃度50 μg/mL，超聲強(qiáng)度6 W /cm2頻率1 MHz 的條件下，通過對CFUs 的計(jì)數(shù)顯示SACT 組95%的細(xì)菌被殺滅，同樣參數(shù)的單純超聲只造成了38%的菌量減少，單純聲敏劑組菌量無變化。本實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)出針對懸浮菌，SDT 顯現(xiàn)出超越單純超聲的滅菌能力。此外，在聲動(dòng)力治療中，更高的HMME 濃度和更強(qiáng)的超聲強(qiáng)度能殺死更多的細(xì)菌［26］。同樣的Nakonechny 等［27］應(yīng)用28 kHz 的超聲，玫瑰紅為聲敏劑，對革蘭陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭陰性的大腸桿菌進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)。不同濃度的玫瑰紅和超聲處理時(shí)間造成細(xì)菌濃度減少3 ～4 log10。

5 總 結(jié)

超聲抗菌從最初針對懸浮態(tài)致病菌，到關(guān)注低頻超聲對菌斑生物膜的促滲作用，經(jīng)過長時(shí)間的發(fā)展，超聲在解決菌斑生物膜模型的滅菌難題上體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，在促滲作用之后超聲介導(dǎo)微泡成為穿透菌斑的又一途徑和研究熱點(diǎn)。而SDT 在抗菌領(lǐng)域的研究雖處于起步階段，但在對懸浮態(tài)細(xì)菌模型的滅菌效果較超聲已經(jīng)體現(xiàn)出優(yōu)越性，不過對菌斑的作用效果目前尚缺乏報(bào)道。SDT 繼承了超聲的無創(chuàng)性和一定的組織穿透性，在之前抗癌研究中表現(xiàn)出對健康組織細(xì)胞具有生物安全性，因此SDT 是很有潛力和研究價(jià)值的抗菌新手段。此外，因聲敏劑多來自光敏劑，使聲光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(sonophotodynamic antimicrobial chemotherapy，SPACT )成為可能，聲光動(dòng)力聯(lián)合治療也許是未來一個(gè)有意義的研究方向。

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