田　華，李嚴(yán)嚴(yán)，丁明德，楊娜娜，焦　鵬，?！』?，，方永奇，姚樹桐，△，秦樹存△(泰山醫(yī)學(xué)院動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，附屬醫(yī)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東泰安7000)

載脂蛋白A-I模擬肽D4F通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡*

田華1▲，李嚴(yán)嚴(yán)1▲，丁明德2，楊娜娜1，焦鵬1，?；?，3，方永奇3，姚樹桐1，3△，秦樹存1△
(泰山醫(yī)學(xué)院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2附屬醫(yī)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000)

目的:探討載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)模擬肽D4F對氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關(guān)鍵分子caspase-12的影響，并闡明其可能的分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)RAW264. 7巨噬細(xì)胞，給予12. 5、25和50 mg/ L D4F、5 mmol/L ERS抑制劑4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)或5 μmol/L二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)預(yù)處理1 h后，再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力; TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況;試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性; Western blot法檢測caspase-12的表達(dá)變化。結(jié)果:與ERS抑制劑PBA相似，D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬細(xì)胞活力降低和凋亡，且呈濃度依賴性(P＜0. 05)。與氧化應(yīng)激抑制劑DPI相似，D4F顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為ROS和MDA生成減少(P＜0. 01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P＜0. 05) ;與PBA和DPI相似，D4F可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞caspase-12活化，且呈濃度依賴性(P＜0. 05) ;另外，D4F還可抑制TM誘導(dǎo)的caspase-12活化(P＜0. 05)。結(jié)論: D4F能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制至少部分是通過減輕氧化應(yīng)激繼而抑制caspase-12活化實(shí)現(xiàn)的。

載脂蛋白A-I模擬肽D4F; Caspase-12;氧化低密度脂蛋白;巨噬細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

▲并列第1作者

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of D4F，an apolipoprotein A-I mimetic peptide，on oxidized lowdensity lipoprotein (ox-LDL) -induced macrophage apoptosis and activation of caspase-12，a key molecule in endoplasmic reticulum stress (ERS ) -associated apoptotic pathway，and to elucidate the underlying molecular mechanisms.METHODS: RAW264. 7 macrophages were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，4-phenylbutyric acid (PBA，5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI，5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM，4 mg/L) for 24 h.The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and TUNEL detection，respectively.The levels of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) in the cells and the activities of superoxide dismutase (SOD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase were determined.The protein level of caspase-12 was examined by Western blot analysis.RESULTS: Similar to the ERS inhibitor PBA，D4F protectedRAW264. 7 macrophages from ox-LDL or TM (an ERS inducer) -induced decrease in the viability and increase in apoptotic rate in a dose-dependent manner.Like DPI (an oxidative stress inhibitor)，D4F significantly inhibited ox-LDL-induced oxidative stress，as expressed by the decreased generation of ROS and MDA (P＜0. 01)，the increased activity of SOD and the decreased activity of NADPH oxidase (P＜0. 05).Moreover，similar to PBA and DPI，D4F significantly suppressed ox-LDL-induced activation of caspase-12 in a concentration-dependent manner (P＜0. 05).Furthermore，D4F also inhibited the caspase-12 activation induced by TM (P＜0. 05).CONCLUSION: D4F inhibits macrophage apoptosis induced by ox-LDL，and the mechanism is at least partially by reducing oxidative stress and inhibiting the activation of caspase-12.

［KEY WORDS］Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophage; Apoptosis

巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的重要病理學(xué)標(biāo)志，且其大量凋亡是易損斑塊形成、破裂的重要因素，進(jìn)而導(dǎo)致AS晚期臨床急性心血管事件的發(fā)生［1］，而由C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和caspase-12等信號分子介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑是導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制［2］。因此，干預(yù)巨噬細(xì)胞ERS凋亡途徑對阻止AS進(jìn)展、降低急性心血管事件發(fā)生率具有重要意義［3］。近年來研究表明高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)主要蛋白成分載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)的模擬肽D4F具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出、抗炎、抗氧化和抗AS功能［4-6］。本實(shí)驗(yàn)室既往研究證實(shí)，D4F可抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，且促進(jìn)小鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞功能，減輕其損傷［7-8］。另外，我們新近研究表明D4F可通過抑制CD36的表達(dá)和ERS-CHOP途徑減輕巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡［9］。然而D4F是否通過抑制介導(dǎo)ERS凋亡途徑的另一關(guān)鍵分子——caspase-12的活化來減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡?其上游分子機(jī)制又如何?上述問題的解決將為進(jìn)一步闡明D4F的抗AS機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本工作分別在ox-LDL和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)所誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞泡沫模型和ERS模型上，研究D4F對caspase-12活化和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以進(jìn)一步分析其對巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

D4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)和紊亂模擬肽(scrambled D4F，sD4F; Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK-NH2)購自中科亞光多肽服務(wù)公司; DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco) ; ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司) ; 2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHFDA)購自Molecular Probes; 4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)、衣霉素(tunicamycin，TM)、二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)和抗β-actinⅠ抗購自Sigma;四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］購自Genview;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記［terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) -mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡檢測試劑盒購自Roche;抗caspase-12Ⅰ抗(Abcam) ;辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(北京中杉金橋公司) ;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Pierce) ;二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜(Millpore) ;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶測定試劑盒(上海杰美科技公司) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組鼠源RAW264. 7巨噬細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至瓶底80%左右用于實(shí)驗(yàn)，處理前用無血清培養(yǎng)基同步化12 h。隨機(jī)分為(1)正常對照(control)組:培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng); (2) ox-LDL組:培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL; (3) D4F預(yù)處理組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入D4F (12. 5、25和50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (4) sD4F預(yù)處理組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入sD4F (50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (5) ERS抑制劑PBA預(yù)處理組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入5 mmol/L PBA作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (6)氧化應(yīng)激抑制劑DPI預(yù)處理組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入5 μmol/L DPI作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培養(yǎng)RAW264. 7巨噬細(xì)胞，預(yù)先給予50 mg/L D4F 或sD4F作用1 h，然后與ERS誘導(dǎo)劑TM (4 mg/L)共孵育。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力胰酶消化細(xì)胞后接種于96孔板中，經(jīng)處理后每孔加入20 μL(0. 5 g/L)的MTT，對照組加入PBS，避光37℃培養(yǎng)4 h，然后吸去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO后室溫振蕩10 min; 490 nm波長下，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀(Tecan)測定各孔的吸光度(A)值。以正常對照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其A值占正常對照組A值的百分比表示，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡在室溫下，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，用PBS沖洗，然后用0. 1%的Triton X-100透化，在冰上孵育2 min。TUNEL反應(yīng)混合物加入到細(xì)胞中，并在37℃避光孵育1 h，然后PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5 min，再用DAPI溶液染色。應(yīng)用熒光顯微鏡(Olympus)檢測，以TUNEL陽性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比來計算細(xì)胞凋亡比率。

2.4活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平測定

將細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)處理后，裝載DCHF-DA熒光探針，使其終濃度為10 μmol/L。在無血清DMEM中37℃孵育30 min后，洗細(xì)胞3次。多功能酶標(biāo)儀(Qiagen)檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。以對照組ROS水平為100%，其它各組ROS水平以其熒光強(qiáng)度占對照組熒光強(qiáng)度的百分比表示。

2.5SOD活性和MDA含量測定細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于0. 5 mL裂解緩沖液中充分裂解，1 500 r/min離心10 min，應(yīng)用試劑盒根據(jù)說明書檢測上清液中SOD活性和MDA含量，分別用×103U/g蛋白和μmol/g蛋白表示。

2.6NADPH氧化酶活性測定應(yīng)用光澤精增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性，具體方法依據(jù)試劑盒說明書操作。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn)按本室以往報道的方法［10］提取細(xì)胞總蛋白，等量的各組總蛋白于SDS-PAGE分離，待目的蛋白接近凝膠底部時停止電泳，4℃、100 V恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉、洗脫后與caspase-12多克?、窨?1∶1 000)和βactin (1∶6 000)單克?、窨故覝胤跤? h，洗膜后與相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色抗原-抗體復(fù)合物，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集。蛋白條帶積分光密度(IA)值采用Image-Pro Plus 6. 0圖像分析軟件(Media Cybernetics)分析，以靶蛋白IA值/β-actin IA值的比值表示靶蛋白相對水平。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示。應(yīng)用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA)，以SNK法進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜ 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1D4F抑制ox-LDL和TM誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞活力降低

RAW264. 7細(xì)胞經(jīng)ox-LDL(100 mg/L)處理24 h，MTT檢測細(xì)胞存活率降低47. 6%。然而，與ox-LDL處理組相比，用不同劑量的D4F(12. 5、25和50 mg/L)預(yù)處理細(xì)胞，細(xì)胞存活率劑量依賴性增加，分別升高27. 6%、53. 2%和60. 5% (P＜0. 05) ; ERS抑制劑PBA作為陽性對照預(yù)處理細(xì)胞后，也減輕了細(xì)胞活力的下降(P＜0. 05)，而紊亂模擬肽sD4F無此作用。此外，與ERS誘導(dǎo)劑TM處理組相比，用D4F (50 mg/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，細(xì)胞存活率升高了27. 7%(P＜0. 05)，見圖1。

Figure 1.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced decrease in viability of RAW264. 7 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖1　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞活力降低

2D4F抑制ox-LDL和TM誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞凋亡

TUNEL染色證實(shí)D4F的抗凋亡作用。與ox-LDL處理組比較，用D4F(25和50 mg/L)預(yù)處理，細(xì)胞凋亡率分別降低了37. 7%和44. 3% (P＜0. 01)，結(jié)果與PBA預(yù)處理組相似，而sD4F預(yù)處理無此作用;同樣，D4F也可以抑制TM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡率降低25. 9%(P＜0. 05)，提示D4F可能通過抑制ERS信號途徑減輕巨噬細(xì)胞凋亡，見圖2。

Figure 2.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced apoptosis of RAW264. 7 cells.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F，sD4F or PBA and then incubated with ox-LDL.The cell apoptosis was detected by TUNEL assay.The scale bar =20 μm.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖2　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞凋亡

3D4F抑制ox-LDL和TM誘導(dǎo)的caspase-12活化

采用Western blot法檢測caspase-12的剪切活化水平(cleaved caspase-12)，與ox-LDL處理組比較，D4F (25、50 mg/L)預(yù)處理組cleaved caspase-12水平減少了49. 8%和59. 0%(P＜0. 05)，其對caspase-12活化的抑制作用與PBA和NADPH氧化酶抑制劑DPI的作用相似，但是sD4F無此作用;同樣，D4F也可抑制TM誘導(dǎo)的caspase-12活化(P＜0. 05)，見圖3。

4D4F抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

與ox-LDL組比較，D4F可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量(P＜0. 01)，并升高SOD活性(P＜0. 05)，其作用與DPI相似，見圖4。

5D4F抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化

與DPI相似，D4F可以明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活化，其活性較ox-LDL組降低28. 8%(P＜0. 05)，見圖5。

討論

在晚期AS病變中，富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞凋亡可促進(jìn)病灶炎性反應(yīng)、壞死和脂質(zhì)核心擴(kuò)大，這可導(dǎo)致斑塊破裂和血栓形成，進(jìn)而引起急性心梗、心源性猝死等急性心血管事件的發(fā)生［1］，因此，抑制巨噬細(xì)胞凋亡可能有效降低急性心血管事件的發(fā)生率。HDL是公認(rèn)的具有膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化等抗AS作用的“好膽固醇”，ApoA-I是其主要蛋白成分和功能執(zhí)行者。但是在AS患者體內(nèi)HDL亞組分改變，如ApoA-I等蛋白成分因氧化或糖基化修飾而使其抗AS功能明顯降低，且由于ApoA-I分子量大，制造起來非常困難并且昂貴，因此限制了其臨床應(yīng)用［11］。D4F是采用生物技術(shù)研制的18個氨基酸片段的Apo A-I模擬肽，具有Apo A-I類似的A型兩親性螺旋結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)泡沫細(xì)胞中膽固醇流出，抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并可抑制AS小鼠粥樣斑塊進(jìn)展［4-6，12］。我們既往研究證實(shí)，D4F可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs損傷［7］，并可下調(diào)巨噬源性泡沫細(xì)胞清道夫受體A1表達(dá)［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D4F可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加、凋亡率降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成、加工、運(yùn)輸和鈣儲存的重要場所，也是損傷感知或凋亡信號整合的主要位點(diǎn)。氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、膽固醇超負(fù)荷等理化改變均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊/誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度ERS通過暫時性減少蛋白質(zhì)的合成、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的折疊及加快未折疊蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)等來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷，從而達(dá)到維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和細(xì)胞生存的目的。但是過強(qiáng)或過久的ERS則可通過激活CHOP、caspase-12等信號途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡［2］。我們前期研究證實(shí)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡是由ERS-CHOP信號途徑介導(dǎo)的，而D4F可通過抑制該信號途徑減輕ox-LDL對巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用［9，13］。Caspase-12是介導(dǎo)ERS凋亡機(jī)制的另一關(guān)鍵蛋白酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，以酶原形式存在，在ERS時被特異性剪切激活，進(jìn)而通過激活caspase-9和caspase-3，啟動一系列caspase級聯(lián)反應(yīng)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。文獻(xiàn)報道，ox-LDL通過激活caspase-12誘導(dǎo)HUVECs凋亡［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以100 mg/L ox-LDL處理RAW264. 7巨噬細(xì)胞24 h，caspase-12剪切活化水平顯著上調(diào)，而ERS抑制劑PBA不僅可明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷和凋亡，而且可減輕caspase-12活化，表明caspase-12是介導(dǎo)ox-LDL所致巨噬細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。與PBA相似，D4F不僅可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力降低和凋亡，而且可抑制ERS誘導(dǎo)劑TM所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡，另外對ox-LDL和TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化均具有明顯抑制作用，表明D4F可通過抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

Figure 3.D4F inhibited ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，sD4F (50 mg/L)，PBA (5 mmol/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖3　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化

Figure 4.Inhibitory effects of D4F on ox-LDL-induced oxidative stress in RAW264. 7 cells.The cells were pretreated with D4F (50 mg/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then stimulated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group.圖4　D4F抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

有研究證明ox-LDL的主要氧化脂質(zhì)成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)經(jīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)人動脈平滑肌細(xì)胞［16］和兔動脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生ERS［17］，表明氧化應(yīng)激可觸發(fā)ERS反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激抑制劑DPI可抑制ox-LDL所致的caspase-12活化，表明ox-LDL通過氧化應(yīng)激反應(yīng)激活caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡信號途徑。ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激主要來自NADPH氧化酶衍生的ROS生成過度和抗氧化酶活性的降低［18］。我們前期工作證實(shí)，D4F可通過抑制氧化應(yīng)激增加色素上皮衍生因子的表達(dá)來減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷［7］。本研究結(jié)果顯示，與DPI相似，D4F可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化以及ROS和MDA生成，并上調(diào)SOD活性，提示D4F對caspase-12的抑制作用與其減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明D4F可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激繼而抑制caspase-12活化有關(guān)。

Figure 5.D4F inhibited ox-LDL-induced NADPH oxidase activation in RAW264. 7 cells.The cells were treated as described and then the activity of NADPH oxidase was determined by lucigenin chemiluminescence.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ox-LDL group.圖5　D4F抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化

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(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12

TIAN Hua1，LI Yan-yan1，DING Ming-de2，YANG Na-na1，JIAO Peng1，SANG Hui1，3，F(xiàn)ANG Yong-qi3，YAO Shu-tong1，3，QIN Shu-cun1
(1Institute of Atherosclerosis，Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities，2Affiliated Hospital，3College of Basic Medical Sciences，Taishan Medical University，Taian 271000，China.E-mail: yst228@126.com; shucunqin@hotmail.com)

R363. 2; R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.004

1000-4718(2015)10-1750-06

2015-04-23

2015-05-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81202949; No.81370381) ;山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合專項(No.ZR2014HL013) ;山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(No.2013WSB31009)

△姚樹桐Tel: 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com;秦樹存Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com