董 進，柯棠山，劉坤祥，2

（1.遵義醫(yī)學院解剖教研室，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學院生物與醫(yī)學中心實驗室，貴州遵義563099）

大鼠失神經(jīng)不同時相的骨骼肌形態(tài)和MyoD表達變化

董 進1，柯棠山1，劉坤祥1，2

（1.遵義醫(yī)學院解剖教研室，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學院生物與醫(yī)學中心實驗室，貴州遵義563099）

目的研究大鼠失坐骨神經(jīng)后MyoD在腓腸肌中不同時相的表達變化，進一步探討骨骼肌失神經(jīng)后再生修復機制。方法將48只2月齡SD雄性大鼠隨機分為八組，每組6只。其中正常對照和失神經(jīng)各四組，于術(shù)后2、7、14、28 d取材，分別標記為Z1、Z2、Z3、Z4組和S1、S2、S3、S4組。在相應的時相內(nèi)取各組大鼠左、右后肢的腓腸肌測肌濕重后凍存以備后續(xù)實驗。計算各組腓腸肌濕重比及其肌腹段HE染色后的橫截面積，Western blotting檢測MyoD在腓腸肌的表達。結(jié)果手術(shù)組失神經(jīng)側(cè)（S1F右、S2F右、S3F右、S4F右）大鼠腓腸肌濕重逐漸減小，且各時相肌濕重比比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HE染色后腓腸肌的各時相平均橫截面積逐漸減小，即各時相組內(nèi)與組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Western blotting檢測各時相失神經(jīng)側(cè)較正常對照組腓腸肌的MyoD表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論大鼠腓腸肌失坐骨神經(jīng)后第1周內(nèi)出現(xiàn)明顯肌萎縮現(xiàn)象，且萎縮速度在失神經(jīng)前2周較快；MyoD蛋白在大鼠失坐骨神經(jīng)后的表達增加，在失神經(jīng)第2周時其表達量最高，隨后開始降低，但仍高于正常大鼠。

骨骼肌； 肌形成調(diào)節(jié)因子； 肌萎縮； 坐骨神經(jīng)； 去神經(jīng)支配； 大鼠，Sprague-Dawley

周圍神經(jīng)損傷所致骨骼肌萎縮是臨床常見的創(chuàng)傷疾病，而肌肉的再生與萎縮是一個復雜的細胞分子生物學調(diào)控過程。近年來相關(guān)研究表明，在此過程中成肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）和轉(zhuǎn)化生長因子具有重要作用。其中MRFs又稱MyoD家族[1-3]，主要包括MyoD、myogenin、myf-5、MRF4等成員，是一組具有生肌能力的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中MyoD、myogenin的作用尤為突出，MyoD對其他類型細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞和成肌細胞在分化為肌管的過程中起重要作用。在特異性基因轉(zhuǎn)錄中起著總開關(guān)的作用；有研究表明，MRFs可參與肌肉損傷修復，相關(guān)研究主要集中于創(chuàng)傷、神經(jīng)源性和肌源性肌?。ㄈ缂I養(yǎng)不良癥）所致的損傷[3-6]。而有關(guān)失神經(jīng)所導致骨骼肌萎縮與MRFs，尤其與MyoD、myogenin蛋白表達的關(guān)系鮮見報道。本研究通過觀察失坐骨神經(jīng)后大鼠骨骼肌MyoD蛋白水平的變化，進一步探討MyoD與骨骼肌失神經(jīng)萎縮變化及修復機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2月齡健康雄性SD大鼠48只[普通級，由重慶第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2007-0005]，體質(zhì)量（220±20）g，隨機分為八組，每組6只，分籠飼養(yǎng)。其中正常對照和失神經(jīng)各四組分別于術(shù)后2、7、14、28 d取材，標記為Z1、Z2、Z3、Z4組和S1、S2、S3、S4組。

1.1.2 主要試劑與儀器 MULTISKAN酶標儀（Thero Scientific），Bio-Rad伯樂Mini-PROTEAN Tetra電泳槽，PowerPacTMBasic電泳儀（BIO-Rad），Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)（LI-COR公司）；HE染色試劑盒，RIPA裂解液（Beyotime），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime），苯甲基磺酰氟（PMSF），Tris（Bio-Rad），十二烷基磺酸鈉（SDS，Sigma），濃鹽酸，5×SDS上樣緩沖液，脫脂奶粉，吐溫-20（Beyotime），PVDF膜，預染蛋白分子量標準（Thermo scientific），兔抗大鼠GAPDH一抗（Proteintech），山羊抗兔熒光二抗。

1.2 方法

1.2.1 失神經(jīng)模型的構(gòu)建 將48只SD大鼠飼喂4 d后進行實驗，隨機分組稱質(zhì)量，標記。四組大鼠去坐骨神經(jīng)模型，用濃度為3 mg/mL戊巴比妥鈉以1 mL/100 g劑量進行腹腔麻醉后，取俯臥位，無菌操作下暴露其坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣剪斷其坐骨神經(jīng)1 cm，縫合皮膚，等待其復蘇，放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠骨骼肌取材 分別于術(shù)后2、7、14、28 d稱質(zhì)量，麻醉后，在無菌條件下取雙后肢的腓腸肌稱其肌濕重，同時計算肌濕重比[（S右/S左）/（Z右/Z左）]。取相應肌腹段約0.5 cm寬放入4%多聚甲醛固定標記以備HE染色。其余放入凍存管于液氮凍存，以備后續(xù)實驗。

1.2.3 肌肉組織HE染色 將已固定的組織標本通過自來水沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水后二甲苯透明后浸蠟包埋，然后將石蠟包埋的組織行8 μm厚的切片，于溫水中攤片用載玻片貼片；再進行脫蠟HE染色，經(jīng)乙醇脫水后甲苯透明，最后中性樹膠封片固定，以備顯微鏡觀察采集圖片，取200倍視野下計算肌肉橫截面積。

1.2.4 Western blotting技術(shù)檢測MyoD蛋白表達 （1）蛋白的提取及定量：液氮研磨法提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）行蛋白定量后再行蛋白變性。（2）電泳：中間各孔加10 μL樣品，兩側(cè)加Marker，5%濃縮膠80 V，20 min；12%分離膠120 V，65 min。（3）轉(zhuǎn)膜：低溫300 mA恒流電轉(zhuǎn)55 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。（4）封閉：5%脫脂奶粉封閉1.5 h。（5）一抗孵育：將一抗孵育PVDF膜4℃過夜后，PVDF膜用TBST洗膜3次，每次5 min。（6）二抗孵育：山羊抗兔熒光二抗在37℃、水平搖床上孵育1.5 h，用TBST洗膜2次，每次5 min，再用TBST洗膜5 min后行Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)曝光。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用Image-Pro Plus軟件計算圖像橫截面積；應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠平均肌濕重比較 同時相手術(shù)組失坐骨神經(jīng)（右）側(cè)腓腸?。⊿XF右，x代表第1、2、3、4組）與其對側(cè)（SXF左）肌濕重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）；手術(shù)側(cè)腓腸肌平均肌濕重隨時間延長逐漸減小，即S1F右與S2F右、S3F右、S4F右平均肌濕重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腓腸肌平均肌濕重比較（±s，g）

表1 各組大鼠腓腸肌平均肌濕重比較（±s，g）

注：與同組同時相左側(cè)比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與同組S1比較，cP＜0.01。

時間 手術(shù)組（n=6）F右 F左時間 正常對照組（n=6）F右 F左S1 S2 S3 S4 1.34±0.06 1.36±0.07 1.50±0.05 1.90±0.06 1.24±0.08a0.95±0.10bc0.73±0.06bc0.56±0.14bcZ1 Z2 Z3 Z4 1.33±0.17 1.49±0.17 1.50±0.18 1.78±0.15 1.33±0.17 1.48±0.17 1.51±0.17 1.78±0.18

2.2 各時相腓腸肌肌濕重比 術(shù)后2、7、14、28 d肌濕重比（0.922、0.703、0.530、0.298）逐漸減小，相鄰兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且肌濕重比隨時間變化第1周內(nèi)萎縮速度最快，第2周后萎縮速度逐漸變緩。見圖1。

圖1 肌濕重比隨時間變化圖

2.3 HE染色后各時相肌肉橫截面積

2.3.1 各時相手術(shù)與正常右側(cè)肌肉形態(tài) 肌肉橫截面積隨失神經(jīng)時間增加而逐漸減小，肌纖維形態(tài)變得不規(guī)整，膠原纖維組織增生，隨失神經(jīng)時間的延長肌萎縮趨勢逐漸減小。見圖2。

2.3.2 各組各時相肌肉橫截面積比較 腓腸肌橫截面同時相手術(shù)側(cè)（SXF右）與其對側(cè)（SXF左）橫截面積比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與同時相正常對照組橫截面積比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；手術(shù)側(cè)腓腸肌相鄰兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。手術(shù)側(cè)腓腸肌橫截面積隨失神經(jīng)時間的延長逐漸減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組各時相MyoD表達情況 各時相手術(shù)組與正常對照組右側(cè)腓腸肌所測MyoD/GAPDH百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；手術(shù)組MyoD蛋白表達量在第14天時出現(xiàn)高峰，隨后開始降低，但仍高于正常對照側(cè)。見圖3、4。

圖2 各組各時相HE染色圖（200×）

表2 各組各時相肌肉橫截面積比較（±s，×102μm2）

表2 各組各時相肌肉橫截面積比較（±s，×102μm2）

注：與同組同時相左側(cè)比較，aP＜0.05；與正常對照組同時相比較，bP＜0.05；cP＜0.05。

時間 手術(shù)組（n=6）F右 F左時間 正常對照組（n=6）F右 F左6.01±0.73 7.62±0.68 8.22±0.81 8.59±0.52 S1 S2 S3 S4 5.11±0.75ab4.52±0.32abc2.97±0.37abc2.03±0.49abc6.04±0.85 7.62±0.34 8.21±0.42 8.61±0.37 Z1 Z2 Z3 Z4 6.00±0.77 7.60±0.38 8.21±0.66 8.59±0.30

圖4 MyoD與GAPDH灰度值百分比條形圖

3 討 論

近年來相關(guān)研究表明，在肌肉的再生與萎縮過程中，MRFs和轉(zhuǎn)化生長因子具有重要作用[4-6]。對其他類型細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞和成肌細胞分化為肌管的過程中起重要作用，在特異性基因轉(zhuǎn)錄中起著總開關(guān)作用。有研究用Oct4的DNA結(jié)合區(qū)域融合性蛋白與MyoD強大轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其具有誘導染色質(zhì)重塑的能力，可使已誘導的多功能干細胞（iPSCs）增加50倍[7]。本實驗結(jié)果顯示，失神經(jīng)的骨骼肌均會出現(xiàn)不同程度的萎縮，且隨著失神經(jīng)支配時間的延長肌肉萎縮程度逐漸增加；并伴隨著一系列的組織形態(tài)學、細胞分子生物學改變，肌肉橫截面積逐漸減小，肌纖維形態(tài)變得不規(guī)整，膠原纖維組織增生，但隨時間的延長肌萎縮速度逐漸減緩。這一結(jié)果可能與成肌調(diào)節(jié)因子的激活有關(guān)。

MyoD是一個具有bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸末端具有強大而簡單的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[6-8]。在肌肉生成方面，MyoD是使許多基因的基因座染色質(zhì)重塑和募集具有活性轉(zhuǎn)錄復合物的主導轉(zhuǎn)錄因子[5，9-10]。胚胎時期，MyoD是由形成體節(jié)過程中的肌源性前體細胞轉(zhuǎn)錄的，對脊柱旁肌肉的形成非常重要[11]。有研究表明，MRFs可參與肌肉損傷修復，且對神經(jīng)源性和肌源性肌?。ㄈ缂I養(yǎng)不良癥）所致的損傷也有一定的修復作用[3-6]。MyoD去神經(jīng)骨骼肌肉中的表達觀點不一，大多數(shù)學者認為去神經(jīng)為上調(diào)，但有的學者研究發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)后MyoD表達不僅不增高反而下降，失神經(jīng)損傷后導致MRFs表達差異的原因至今仍不太清楚[5，12-13]。研究表明，大鼠失神經(jīng)性損傷的骨骼肌中肌衛(wèi)星細胞MyoD+、myogenin+在損傷后的早期表達上調(diào)，2個月后急劇下降，1年后幾乎不能檢測到肌衛(wèi)星細胞的存在[14-15]。本實驗研究表明，各時相失神經(jīng)骨骼肌中MyoD蛋白表達量均較正常對照組增加；且失神經(jīng)組MyoD蛋白表達量在術(shù)后14 d時出現(xiàn)高峰，術(shù)后28 d時表達量降低但仍高于正常對照側(cè)。

大鼠腓腸肌失坐骨神經(jīng)后7 d內(nèi)出現(xiàn)明顯肌萎縮，且萎縮速度較快；MyoD蛋白在大鼠失坐骨神經(jīng)后的表達增加，在失神經(jīng)后7 d其表達量最高，隨后開始降低，但仍高于正常對照組。由于大鼠失神經(jīng)出現(xiàn)肌萎使MyoD蛋白表達增加，從而減緩了大鼠肌肉的萎縮速度，而長時間失神經(jīng)可導致不可逆性肌萎縮，從而刺激MyoD蛋白進一步表達增加；而由于成肌細胞逐漸耗竭和某些凋亡因子的作用，導致了MyoD蛋白的表達又開始逐漸減少，從而出現(xiàn)了表達高峰。

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Changes in the protein expression of MyoD and the skeletal muscles morphology of rats after denervation in different time phases

Dong Jin1，Ke Tangshan1，Liu Kunxiang1，2
（1.Department of Anatomy，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China；2.Central Laboratory of Biology and Medicine，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China）

ObjectiveTo explore the expression changes of MyoD after losing the sciatic nerve in rats′gastrocnemius musle at different time phases in order to investigate the skeletal muscle regeneration and repair mechanisms after denervation further.MethodsA total of 48 male SD rats aged 2-month-old were randomly divided into 8 groups，6 of each group including the 4 normal control groups and the 4 nerve-lost groups，obtaining the samples after 2，7，14，28 d respectively，marking group Z1，Z2，Z3，Z4and group S1，S2，S3，S4.It was removed the gastrocnemius muscle from the latter legs of each group in the different time phases to measure their wet muscle weight and then frozed to prepare the following experiements.The wet weight ratio of the gastrocnemius muscle and the cross-sectional area of musle belly setions stainied by HE.The expression of gastrocnemius muscle was detected by Western blotting.ResultsThe wet musle weight was gradually decreased in the denervation side（S1Fright，S2Fright，S1Fright，S4Fright）from the operation groups.There were statistically significant compared the wet weight among the above time pahses（P＜0.05）.The average cross-sectional area after HE staining was declined at different time phases，whose difference had statisti cal significance within the group and among the groups（P＜0.05）.The denervation sides in various time phases were increased than the normal control groups in MyoD protein by Western blotting.The difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe amyotrophy occurred within 1 week after loseing ischiadic nerve of rats′gastrocnemius muscle and accelerated in the first two weeks.The MyoD protein expression were increased after loseing their ischiadic nerve.The expression amount reaches the peak at the second week of denervation，then began to decrease but still higher than controls.

Muscle，skeletal； Myogenic regulatory factors； Muscular atrophy； Sciatic nerve； Denervation；Rats，sprague-dawley

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.002

：A

：1009-5519（2015）08-1124-03

2015-01-08）

貴州省科學技術(shù)基金項目（黔科合J字[2009]2號）。

董進（1987-），男，貴州沿河人，在讀碩士研究生，主要從事骨骼肌失神經(jīng)萎縮方面的研究；E-mail：601137533@qq.com。

劉坤祥（E-mail：1684429795@qq.com）。