趙會(huì)靜，張敬敬，文 杰，劉冉冉，鄭麥青，李慶賀，馬月輝，趙桂蘋

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

15個(gè)雞群體IL-2基因的遺傳變異分析

趙會(huì)靜，張敬敬，文 杰，劉冉冉，鄭麥青，李慶賀，馬月輝，趙桂蘋*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

為了深入研究雞IL-2基因的多態(tài)性及為雞抗病育種提供理論依據(jù)，本研究以IL-2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用直接測(cè)序的方法對(duì)11個(gè)中國(guó)地方雞品種、3個(gè)引進(jìn)雞品種和1個(gè)培育雞品種共448個(gè)個(gè)體該基因的遺傳變異進(jìn)行了分析。通過DNA池和直接測(cè)序技術(shù)，共發(fā)現(xiàn)了13個(gè)突變位點(diǎn)。對(duì)所有個(gè)體的一段包含5個(gè)SNPs的區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同等位基因在15個(gè)雞群體間分布存在顯著差異，表明不同品種間IL-2基因具有豐富的遺傳變異資源，可為抗病基因的選擇提供素材；群體遺傳學(xué)指標(biāo)分析表明，H系京星黃雞的遺傳多樣性最低，這與其品種形成過程一致，其他品種多樣性差異不大；單倍型分析共發(fā)現(xiàn)23種單倍型，其中H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)為中國(guó)地方雞品種特有或優(yōu)勢(shì)單倍型，可能與抗病能力相關(guān)。

雞；IL-2基因；遺傳多樣性

一直以來，疫病是養(yǎng)雞業(yè)的第一大天敵，尤其是一些烈性傳染病，嚴(yán)重制約著家禽業(yè)的發(fā)展。目前我國(guó)禽病有80余種，其中傳染病占75%左右，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大[1]。在現(xiàn)今集約化程度提高、飼養(yǎng)條件改變以及禽類疾病復(fù)雜化的背景下，家禽遺傳育種者一直在不斷的探索減少這種經(jīng)濟(jì)損失的途徑。其中，選育抗病能力強(qiáng)的雞品種、對(duì)雞抗病力的遺傳規(guī)律進(jìn)行深入的研究成為從根本上解決問題的一個(gè)重要手段。

白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是由T淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，具有促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖和分化、增強(qiáng)單核細(xì)胞核NK細(xì)胞的殺傷活性、誘導(dǎo)淋巴因子激活殺傷細(xì)胞活性、促進(jìn)其他細(xì)胞因子釋放的功能，在機(jī)體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。雞IL-2被認(rèn)為是影響雞免疫系統(tǒng)的發(fā)生及免疫調(diào)節(jié)的重要因子之一[3]。Q.L.Liang等[4]發(fā)現(xiàn)雞胚成纖維細(xì)胞受到H5N1病毒感染后，IL-2 基因表達(dá)升高，并在整個(gè)感染過程中維持高表達(dá)狀態(tài)。Y.C.Wang等[5]報(bào)道在25 mg·mL-1的玉米赤霉烯酮感染48 h，與對(duì)照組相比雞脾淋巴細(xì)胞的IL-2 基因表達(dá)水平提高了4倍。 G.D.Raj等[6]研究發(fā)現(xiàn)，商品化雞在感染傳染性法氏囊病毒后，脾IL-2 基因的表達(dá)水平顯著提高。此外，IL-2 可作為免疫治療劑和免疫佐劑。李宏梅[7]用法氏囊疫苗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)雞細(xì)胞免疫水平的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，雞IL-2 能夠提高疫苗的免疫效果。同時(shí)，利用基因重組的方法將IL-2 基因和某種病毒基因重組獲得IL-2 抗原重組蛋白，是研制新一代基因工程疫苗的有效途徑。亓麗紅等[8]構(gòu)建了雞IL-2 基因與新城疫病毒蛋白的重組質(zhì)粒并用此質(zhì)粒感染雞胚胎成纖維細(xì)胞，結(jié)果表明，該重組質(zhì)粒可提高細(xì)胞的抗體反應(yīng)能力。H.Song等[9]將雞IL-2 基因和艾美耳球蟲遮光體抗原SO7基因分別插入pVAX1載體中制備疫苗，并用此疫苗免疫雞，發(fā)現(xiàn)，IL-2 基因的表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)艾美球蟲疫苗的免疫原性。

對(duì)雞IL-2基因序列多態(tài)性的研究也已經(jīng)逐步開展。R.S.Sundick等[10]首次克隆了雞IL-2基因mRNA序列，發(fā)現(xiàn)其mRNA全長(zhǎng)747 bp，推測(cè)編碼143個(gè)氨基酸。P.Kaiser等[11]采用RACE技術(shù)獲得雞IL-2全基因序列，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于第4號(hào)染色體上，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。此后，國(guó)內(nèi)的眾多學(xué)者相繼克隆出了固始雞、蕭山雞、白羽烏骨雞等十多個(gè)地方品種的IL-2基因的mRNA序列，與R.S.Sundick等[10]公布的雞IL-2基因序列的相似性均在97%以上，證明了雞IL-2 cDNA的保守性，同時(shí)一些位于編碼區(qū)的SNPs位點(diǎn)也被確定[12-14]。R.Tohidi等[15]研究表明，雞IL-2 基因的變異與盲腸及脾中腸炎沙門氏菌感染顯著相關(guān)，為雞IL-2 基因在免疫性狀中的作用提供了有力的證據(jù)。這些研究大多數(shù)只是關(guān)注少數(shù)個(gè)體的mRNA序列，而忽略了內(nèi)含子上的變異以及群體水平的研究。本研究以11個(gè)中國(guó)地方雞品種、3個(gè)引進(jìn)品種和1個(gè)培育品種為研究對(duì)象，采用DNA池技術(shù)和直接測(cè)序方法對(duì)雞IL-2基因的SNP進(jìn)行篩選，然后選擇其中遺傳變異豐富的一端DNA區(qū)域，對(duì)該區(qū)域內(nèi)的5個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型、雜合度、多態(tài)信息含量等群體遺傳學(xué)屬性以及不同群體單倍型的分布情況進(jìn)行分析，并尋找可能與雞抗病性相關(guān)的單倍型，為更加深刻的了解雞DNA多樣性與經(jīng)濟(jì)性狀多樣性之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以11個(gè)中國(guó)地方品種、3個(gè)引進(jìn)品種和1個(gè)培育品種共448個(gè)樣品為研究對(duì)象。其中地方品種包括狼山雞(30只)、仙居雞(30只)、白耳雞(30只)、茶花雞(30只)、溧陽(yáng)雞(30只)、河南斗雞(30只)、烏骨雞(30只)、油雞(30只)、絲羽烏骨雞(30只)、壩上長(zhǎng)尾雞(29只)、河北柴雞(22只)，引進(jìn)品種包括隱性白羽肉雞(30只)、科寶雞(29只)、白來航雞(30只)，培育品種為京星黃雞(38只)。以上樣本來自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所和江蘇家禽研究所。每只雞采集翅下靜脈血液1.5 mL，加0.3 mL抗凝劑ACD，置于2 mL離心管中-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取

參考《分子克隆(第3版)》的方法提取基因組DNA[16]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，用滅菌超純水稀釋為50 ng·μL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP檢測(cè)

對(duì)每個(gè)雞品種制備2個(gè)DNA池作為模板，每個(gè)池隨機(jī)混合10個(gè)樣本的DNA，參考雞IL-2全基因組DNA序列(GenBank登錄號(hào)：AJ224516)，利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)覆蓋全基因序列的4對(duì)引物(表1)，對(duì)每個(gè)DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增用以篩選雞IL-2基因的SNP位點(diǎn)。由于第3對(duì)引物擴(kuò)增序列多態(tài)性最為豐富(包含5個(gè)SNPs)，用該對(duì)引物對(duì)15個(gè)群體共448個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步研究不同群體間IL-2基因的遺傳多樣差異。

表1 引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物

Table 1 Information of primers sequences and PCR production

引物名稱Name序列Sequence起始位置/bpStartposition片段長(zhǎng)度/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureIL-2-1F:GGCATTAAGACATACGGGR:AAATCAAAGGCAGAAGTG上游調(diào)控區(qū)-67～1126119352IL-2-2F:GTTTTCCTCTATCAGTTCTTTR:TTTTACAGTGGCAATCTTC806～2234142950IL-2-3F:GTACCCATACTCAAGGTCR:TGCATTCACTTCCGGTGT2048～3248120153IL-2-4F:CCTGGGAGAAGTGGTTACR:TGGTTTGGGATTCTTTCG2700～下游調(diào)控區(qū)92121155

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)送公司測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Mega 4.0軟件分析DNA序列的變異位點(diǎn)，確定等位基因；用Excel計(jì)算等位基因頻率；用SPSS軟件對(duì)各群體等位基因頻率分布差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；用Genepop軟件包對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢測(cè)以及觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、有效等位基因數(shù)(NE)等群體遺傳學(xué)指標(biāo)；用PIC_CALC軟件計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)；用Phase 2.0軟件對(duì)研究個(gè)體進(jìn)行單倍型分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

將所提取的每個(gè)樣品的基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，DNA質(zhì)量較好并且比較完整，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。用分光光度計(jì)對(duì)各基因組DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將其濃度調(diào)整到50 ng·μL-1左右備用。利用所設(shè)計(jì)的4對(duì)引物，以制備的DNA池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)都有較好的效果，與預(yù)計(jì)的擴(kuò)增片段大小一致，且沒有非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(圖1)，各位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物適合進(jìn)行測(cè)序分析。

1～4.IL-2-1～I(xiàn)L-2-4擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-4．PCR products of IL-2-1-IL-2-4 primers；M.DNA marker圖1 IL-2基因4對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products for 4 primers of IL-2

2.2IL-2基因SNP鑒定

結(jié)合DNA池和直接測(cè)序方法，在雞IL-2 基因上共檢測(cè)到13個(gè)SNPs，其位置信息、突變方式及基因結(jié)構(gòu)上的分布見表2。其中SNP1、SNP2、SNP3、SNP8和SNP13位于外顯子上，其余SNPs位點(diǎn)位于內(nèi)含子上。位于外顯子上的SNPs中，SNP1與SNP2為非同義突變，分別引起第27位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸和第29位精氨酸突變?yōu)楦拾彼幔硗?個(gè)SNPs(SNP3、SNP8和SNP13)為同義突變。就4對(duì)引物擴(kuò)增序列上SNPs的分布密度而言，引物3包含5個(gè)突變位點(diǎn)，擴(kuò)增序列多態(tài)性最為豐富，分別為SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10，表明該區(qū)域多態(tài)性最為豐富。因此，本研究接下來將重點(diǎn)關(guān)注引物3擴(kuò)增區(qū)域在所有樣本中的遺傳變異情況。

表2 雞IL-2基因13個(gè)SNPs的信息

Table 2 The information of 13 SNPs of chickenIL-2 gene

項(xiàng)目ItemSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP9SNP10SNP11SNP12SNP13位置/bpPosition7337387941002100825672582279928532890299630913813突變MutationC/TA/GC/TT/CT/CC/TA/GT/AT/CG/TC/AG/TA/G分布DistributionExon1Exon1Exon1Intron2Intron2Intron2Intron2Exon3Intron3Intron3Intron3Intron3Exon4

位置信息參考序列GenBank登錄號(hào)：AJ224516

SNPs numbered in relation to DNA nucleotide positions(GenBank accession No.：AJ224516)

2.3 5個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率與H-W平衡檢測(cè)

用第3對(duì)引物對(duì)15個(gè)雞品種的448個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得所有個(gè)體5個(gè)SNPs(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的基因型數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)各群體各位點(diǎn)的等位基因頻率，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯?5個(gè)雞群體的5個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了突變。SNP1位點(diǎn)在除了狼山雞以外的其他品種中，T等位基因均為優(yōu)勢(shì)等位基因，尤其是在京海黃雞、白耳雞、茶花雞和絲羽烏骨雞中，T等位基因占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，等位基因頻率均在90%以上；SNP2位點(diǎn)在各群體中的等位基因頻率與SNP1位點(diǎn)完全一致或接近，表明這2個(gè)位點(diǎn)在所有群體中可能都處于緊密連鎖狀態(tài)；SNP3位點(diǎn)在不同群體中基因型頻率分布不同，其中京海黃雞群體突變率最低，最小等位基因頻率(等位基因T)為0.118；SNP4位點(diǎn)的T等位基因在大多數(shù)雞群體為優(yōu)勢(shì)等位基因，而在3個(gè)中國(guó)地方品種(白耳雞、烏骨雞和油雞)、1個(gè)引進(jìn)品種(隱性白羽雞)和京海黃雞中，該等位基因頻率較C等位基因頻率低；SNP5位點(diǎn)在各群體中等位基因頻率與SNP4位點(diǎn)完全一致或接近，表明SNP4和SNP5位點(diǎn)在所有群體中可能都處于緊密連鎖狀態(tài)?？ǚ綑z驗(yàn)表明，所有位點(diǎn)的2個(gè)等位基因在15個(gè)雞群體中分布有極顯著差異(表3)。同時(shí)，將15個(gè)雞群體按照品種來源歸為中國(guó)地方品種、引進(jìn)品種和培育品種，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明所有位點(diǎn)的2個(gè)等位基因在這3個(gè)類群中的分布也有極顯著差異(表3)。但由于各位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因在3個(gè)雞群體中沒有明顯的分布規(guī)律，因而不能確定哪個(gè)等位基因可能與較強(qiáng)的免疫能力有關(guān)。

H-W平衡檢測(cè)表明，所有群體的5個(gè)位點(diǎn)都處于H-W平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.4 5個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)指標(biāo)分析

表4展示了各個(gè)群體5個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、有效等位基因數(shù)(NE)和多態(tài)信息含量(PIC)等群體遺傳學(xué)參數(shù)的平均值。可以看出，烏骨雞的觀測(cè)雜合度最高，為0.553，而京星黃雞觀測(cè)雜合度最低,為0.195。比較而言，溧陽(yáng)雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長(zhǎng)尾雞、科寶雞和白來航雞觀察雜合度低于期望雜合度，表明群體中純合子個(gè)體較多；而其他群體觀察雜合度都接近期望雜合度，說明這些群體受外來選擇及近交等因素的影響較小。有效等位基因數(shù)(NE)是反映群體遺傳變異的一個(gè)重要指標(biāo)[17]，結(jié)果表明，京星黃雞有效等位基因數(shù)接近1，表明該雞品種突變率較低，變異度小，而其他品種接近于2，表明這些群體5個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因在群體內(nèi)分布較為均勻；多態(tài)信息含量分析表明，京星黃雞處于低度多態(tài)(PIC<0.25)，而其他品種則為中度多態(tài)(0.25

2.5 單倍型分析

利用Phase 2.0軟件包對(duì)15個(gè)不同雞群體進(jìn)行單倍型分析，共得到23種單倍型(表5)， 表明所研究雞群體豐富的多樣性。其中單倍型H9在群體中的頻率最高，為15.7%；而單倍型H20和H22在所有群體中頻率僅為0.1%。從表5中可以看出，頻率最高的單倍型H9，被8個(gè)中國(guó)地方雞群體共享，這8個(gè)雞群體分別為狼山雞、仙居雞、茶花雞、溧陽(yáng)雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長(zhǎng)尾雞和河北柴雞，而引進(jìn)品種中，只在白來航雞群體中檢測(cè)到，培育品種中不存在該單倍型。單倍型H13被3個(gè)中國(guó)地方雞品種(白耳雞、油雞和壩上長(zhǎng)尾雞)和2個(gè)引進(jìn)品種(科寶雞和白來航雞)所共享；而單倍型H5在中國(guó)地方雞品種(狼山雞、仙居雞、茶花雞、溧陽(yáng)雞和河北柴雞)、2個(gè)引進(jìn)品種(隱性白羽雞和白來航雞)以及培育品種京海黃雞中都有分布。

表5 單倍型頻率

Table 5 Frequency of haplotypes

單倍型Haplotype位點(diǎn)Loci樣本數(shù)Samplenumber頻率FrequencyH1CAACG420.047H2CAATT240.027H3CATTT20.002H4CGACT290.032H5CGATG950.106H6TATCG210.023H7TATTT690.077H8TGTCG480.054H9TGTTG1410.157H10TGTCT700.078H11TATCG910.102H12CGACG280.031H13TGTTT960.107H14CAATG420.047H15CAACG440.049H16CATCG20.002H17TGACG20.002H18TATTG350.039H19CGATT80.009H20CATCG10.001H21CGTTG20.002H22TGATG10.001H23TAACT30.003

另外，從表6中可以看出，單倍型H1、H2、H3、H4、H6、H16、H17、H19、H20、H21為中國(guó)地方雞品種特有的單倍型，在引進(jìn)品種和培育品種中不存在。其中，單倍型H1、H2、H4和H16均在4個(gè)及以上地方品種中檢測(cè)到；同時(shí)，單倍型H9和H11雖不是中國(guó)地方雞品種所特有，但其只在某個(gè)引進(jìn)品種少數(shù)樣品中檢測(cè)到。因此，單倍型H1、H2、H4、H9、H11及H16很有可能與中國(guó)地方雞品種較強(qiáng)的免疫能力相關(guān)。而單倍型H22和H23為引進(jìn)品種所特有，但單倍型頻率都很低。

3 討 論

P.Kaiser等[11]通過研究8個(gè)自交系的白來航雞，發(fā)現(xiàn)雞的IL-2基因中長(zhǎng)為517 bp的啟動(dòng)子區(qū)域的序列和它的4個(gè)外顯子均沒有變異。陳吉?jiǎng)偟萚12]克隆了絲羽烏骨雞的IL-2 基因，與Kestrel、Obese和SC品系的來航雞相比發(fā)現(xiàn)，不同品系雞IL-2 其編碼氨基酸在15、28、30、32和 133位發(fā)生了改變。王彥彬等[13]克隆了固始雞IL-2基因的cDNA序列，與已發(fā)表的序列相比發(fā)現(xiàn)了2個(gè)核苷酸變異。黃溢泓等[14]克隆了廣西10個(gè)地方品種雞IL-2 基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)不同品種雞編碼氨基酸在第60位、第127位、第132位、第138位、第192位、第204位、第256位和第457位發(fā)生改變。本研究在15個(gè)雞群體中共檢測(cè)到13個(gè)SNPs(表2)，表明雞IL-2的遺傳變異非常豐富，這是為了適應(yīng)多樣化的生存環(huán)境經(jīng)受的選擇作用的結(jié)果。而本研究檢測(cè)到的位于第27位(SNP1)和第29位(SNP2)氨基酸序列的兩個(gè)非同義突變位點(diǎn)在以往的研究中沒有報(bào)道過，因此，為雞IL-2 基因的研究提供了新的重要的遺傳變異資源。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)了8個(gè)位于雞IL-2 基因內(nèi)含子上的突變位點(diǎn)。事實(shí)上，內(nèi)含子具有促進(jìn)或抑制基因表達(dá)[18-19]的作用，因此對(duì)基因功能有重要的影響。筆者前期通過比對(duì)GenBank上的2個(gè)雞的IL-2基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子中存在插入缺失位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以將這2個(gè)DNA序列劃分為2個(gè)分支[20]，也說明了對(duì)不同遺傳背景雞群IL-2基因內(nèi)含子研究的必要性。另一方面，從群體水平上對(duì)雞IL-2基因的研究也尚未見報(bào)道。

基于以上背景，以15個(gè)雞群體的448個(gè)樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的IL-2 基因的包含5個(gè)SNPs位點(diǎn)(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的高變異區(qū)域的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。這5個(gè)突變位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)位于內(nèi)含子2上(SNP1和SNP2)，1個(gè)位點(diǎn)位于外顯子3上(SNP3)，另外2個(gè)位點(diǎn)位于內(nèi)含子3上(SNP4和SNP5)(表2)。等位基因頻率分布結(jié)果顯示，除狼山雞以外，SNP1(T>C)和SNP2(G>A)位點(diǎn)在所有雞群體中優(yōu)勢(shì)等位基因分布大致相同，可能是由于對(duì)狼山雞某一性狀的選育造成的這2個(gè)位點(diǎn)受到人工選擇的影響導(dǎo)致的，也有可能是品種形成之初等位基因的分布就是這樣的。而另外3個(gè)SNP位點(diǎn)在不同群體中等位基因頻率分布及優(yōu)勢(shì)等位基因分布差異較大，反映了不同雞群生長(zhǎng)環(huán)境和選育程度的不同。

表6 23種單倍型在15個(gè)群體中的分布

Table 6 The distribution of 23 haplotypes in 15 populations

單倍型Haplotype群體PopulationLSXJBECHLYHNDWGYJSYWGBSCWHBCYXBYKBBLHHH122000080011100000H2100606009200000H3200000000000000H41000061602220000H52170414000005220229H64013000300100000H715005000001190038H81605011004616404H9119026929002812140030H100507476244203260H1102011518200121148000H12041080000130605H13003000002808002640H1400700001304006120H1500301001604011360H16000200000000000H17000001000010000H180000002700100070H19000000800000000H20000000010000000H21000000000110000H22000000000001000H23000000000003000

雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等群體遺傳學(xué)指標(biāo)是衡量遺傳多樣性雞變異水平的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)15個(gè)群體5個(gè)位點(diǎn)的平均期望雜合度在0.177～0.481波動(dòng)，其中壩上長(zhǎng)尾雞的期望雜合度最高，而京星黃雞期望雜合度最低。雜合度越高說明品種的遺傳多樣性越豐富，相反，京星黃雞是用地方品種資源為育種素材，經(jīng)世代閉鎖繁育形成的培育品種，有效群體及遺傳變異有限，遺傳血統(tǒng)狹窄，因此雜合度較低。另一方面，溧陽(yáng)雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長(zhǎng)尾雞、科寶雞和白來航雞觀察雜合度低于期望雜合度，表明群體中純合子個(gè)體較多，說明這些群體中存在一定程度的近交；還可能與長(zhǎng)期對(duì)某一性狀進(jìn)行選擇，造成整體遺傳背景趨向單一相關(guān)；也可能由于群體歷史因素如瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)等造成的基因純合較多現(xiàn)象。另外，有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量分析也證明了京星黃雞的突變率較低，2個(gè)指標(biāo)在京星黃雞中分別為0.124和0.158。

SNP位點(diǎn)通過單倍域的形式遺傳給后代，單倍域內(nèi)全部的SNP類型被稱為單倍型[21]。以往的研究表明，根據(jù)單倍型可以有效的鑒定可能與疾病相關(guān)的變異[22]。本研究在15個(gè)雞群體中共發(fā)現(xiàn)23種單倍型(表5)，其中京星黃雞僅含有H5、H7、H8、H12 4種單倍型，其他雞群體中出現(xiàn)的單倍型種類為5～14個(gè)不等，以壩上長(zhǎng)尾雞最多，表明這些雞種較培育品種雞具有更廣闊的選育空間。同時(shí)，在地方品種雞特有的單倍型中，單倍型H1、H2、H4和H16為多個(gè)雞群所共享，而單倍型H9和H11只在某個(gè)引進(jìn)品種的少數(shù)樣品中檢測(cè)到，其余全部分布在地方品種中(表6)。一般認(rèn)為，地方雞群體在品種形成過程中人工選擇干預(yù)的強(qiáng)度較小，因此其適應(yīng)自然環(huán)境的能力和抗逆性較強(qiáng)；而引進(jìn)品種和培育品種在現(xiàn)代高強(qiáng)度的選擇選育過程中，對(duì)人工環(huán)境較為依賴，因而抗逆性稍差。因此，以上6種地方品種中優(yōu)勢(shì)的單倍型(H1、H2、H4、H9、H11和H16)可能與疾病抵抗能力相關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)IL-2基因的SNP進(jìn)行了篩選并研究了5個(gè)SNPs位點(diǎn)在11個(gè)中國(guó)地方雞品種、3個(gè)引進(jìn)雞品種和1個(gè)引進(jìn)雞品種中基因頻率分布，以及各群體平均觀察雜合度、平均期望雜合度、平均有效等位基因數(shù)、平均多態(tài)信息含量等群體遺傳學(xué)指標(biāo)，并對(duì)各個(gè)樣品的單倍型進(jìn)行推導(dǎo)，研究單倍型在不同群體中的分布。筆者發(fā)現(xiàn)IL-2基因在不同雞群體中多樣性有明顯差異，可作為抗病基因素材，同時(shí)，H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)可能與疾病抵抗能力相關(guān)。

[1] 李海華，胡剛安.優(yōu)質(zhì)雞的抗病育種研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，(2)：68-69. LI H H,HU G A.Studies on disease resistance of high quality chicken[J].ShanghaiJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2010,(2):68-69.(in Chinese)

[2] MERLUZZI V，WELTE K，SAVAGE D，et al.Expansion of cyclophosphamide-resistant cytotoxic precursorsinvitroandinvivoby purified human interleukin 2[J].JImmunol，1983，131(2)：806-809.

[3] 閆峰賓，康相濤，王彥彬.雞白細(xì)胞介素-2的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，(4)：74-77. YAN F B，KANG X T，WANG Y B.Chicken interleukin-2 and its foreg round of application[J].GuangdongAgriculturalSciences，2006，(4)：74-77.(in Chinese)

[4] LIANG Q L，LUO J,ZHOU K，et al.Immune-related gene expression in response to H5N1 avian influenza virus infection in chicken and duck embryonic fibroblasts[J].MolImmunol，2011，48(6)：924-930.

[5] WANG Y C，DENG J L，XU S W，et al.Effects of zearalenone on IL-2，IL-6，and IFN-γ mRNA levels in the splenic lymphocytes of chickens[J].SciWorldJ，2012，(2012)：1-5.

[6] RAI G D,RAIANATHAN C T M,KUMANNAN K,et al.Changes in the cytokine and toll-like receptor gene expression following infection of indigenous and commercial chickens with infectious bursal disease virus[J].IndJVirol，2011，22(2)：146-151.

[7] 李宏梅.重組雞白細(xì)胞介素-2 作為免疫增強(qiáng)劑的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000. LI H M.Research of recombinant chicken interleukin-2 as an immune enhancer[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2000.(in Chinese)

[8] 亓麗紅，朱劍英，艾 武，等.雞新城疫病毒F基因與雞白介素-2(IL-2)基因在真核載體中串連表達(dá)及免疫原性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20(11)：1327-1332. QI L H，ZHU J Y，AI W，et al.Tandem-expressing of Newcastle disease virus F and chicken interleukin-2(IL-2) genes in Eukaryotic expression vector and their immunogenicity[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2012，20(11)：1327-1332.(in Chinese)

[9] SONG H，QIU B，YAN R，et al.The protective efficacy of chimeric SO7/IL-2 DNA vaccine against coccidiosis in chickens[J].ResVetSci，2013，94(3)：562-567.

[10] SUNDICK R S,GILL-DIXON C.A cloned chicken lymphokine homologous to both mammalian IL-2 and IL-15[J].JImmunol，1997，159(2)：720-725.

[11] KAISER P,MARIANI P.Promoter sequence，exon：intron structure，and synteny of genetic location show that a chicken cytokine with T-cell proliferative activity is IL-2 and not IL-15[J].Immunogenetics，1999，49(1)：26-35.

[12] 陳吉?jiǎng)?，周繼勇，鄭肖娟.中國(guó)地方品種絲羽烏骨雞白細(xì)胞介素2基因的克隆及遺傳進(jìn)化分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25(1)：21-23. CHEN J G，ZHOU J Y ,ZHENG X J.Cloning and genetic analysis of interleukin 2 gene in silken feather silky chicken of chinese local breed[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2003，25(1)：21-23.(in Chinese)

[13] 王彥彬，盧中華，康相濤，等.固始雞白細(xì)胞介素2基因的克隆,表達(dá)及其表達(dá)蛋白活性的檢測(cè)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，5(15)：66-71. WANG Y B，LU Z H ，KANG X T，et al.Cloning and expression of Gushi-chicken interleukin 2 gene and detection of its biological activity[J].JournalofNorthuestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)，2006，5(15)：66-71.(in Chinese)

[14] 黃溢泓，謝芝勛，孫建華.廣西 10 個(gè)地方優(yōu)質(zhì)品種雞白細(xì)胞介素2基因的克隆與序列分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39(1)：7-10. HUANG Y H,XIE Z X,SUN J H.Molecular cloning and sequencing analysis of interleukin-2 gene from 10 kinds of Guangxi local chickens[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2007,39(1):7-10.(in Chinese)

[15] TOHIDI R,IDRIS I B,PANANDAM J M,et al.The effects of polymorphisms in IL-2，IFN-γ，TGF-β2，IgL，TLR-4，MD-2，and iNOS genes on resistance to Salmonella Enteritidis in indigenous chickens[J].AvianPathol，2012，41(6)：605-612.

[16] JOSEPH S,DAVID W.Molecular cloning：a laboratory manual[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001：2.

[17] MARUYAMA T.Effective number of alleles in a subdivided population[J].TheoretPopulatBiol，1970，1(3)：273-306.

[18] HORMUZDI S G,PENTTINEN R,JAENISCH R,et al.A gene-targeting approach identifies a function for the first intron in expression of the α1(I) collagen gene[J].MolCellBiol，1998，18(6)：3368-3375.

[19] CHANG K.Critical regulatory domains in intron 2 of a porcine sarcomeric myosin heavy chain gene[J].JMuscleResCellMotil，2000，21(5)：451-461.

[20] ZHANG D P,ZHAO H J，LUO Y Z，et al.Characterization of haplotype diversity defined by discontinuous insertions/Deletions within the Intron 2 of interleukin 2 in different domestic chicken populations[J].JBiolSci，2011，11(3)：261-267.

[21] GABRIEL S B,SCHAFFNER S F,NGUYEN H,et al.The structure of haplotype blocks in the human genome[J].Science，2002，296(5576)：2225-2229.

[22] WU H,BOACKLE S A,HANVIVADHANAKUL P,et al.Association of a common complement receptor 2 haplotype with increased risk of systemic lupus erythematosus[J].ProcNatlAcadSci，2007，104(10)：3961-3966.

(編輯 郭云雁)

Genetic Diversity ofIL-2 Gene in 15 Chicken Populations

ZHAO Hui-jing，ZHANG Jing-jing,WEN Jie,LIU Ran-ran, ZHENG Mai-qing,LI Qing-he,MA Yue-hui,ZHAO Gui-ping*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

To deeply study the genetic diversity of chicken Interleukin 2 (IL-2) gene and provide a theoretic basis for the breeding for disease resistance，the genetic variation ofIL-2 were studied in 448 individuals from 11 Chinese native，3 introduced and one cultivated chicken breeds by DNA sequencing method in this study.A total of 13 SNPs were identified by using DNA-pooling and sequencing.The results of analysis for a genome region including 5 single nucleotide polymorphisms(SNPs) among all the individuals showed that the frequencies of different alleles differed significantly among 15 populations，suggestingIL-2 had abundant genetic variations and provided promising gene resource for disease resistance.Analysis of several population genetic indexes indicated that the Jingxing Yellow chicken had the lowest level of genetic diversity,which was consistent with its breed formation and little differences of genetic diversity were observed among other breeds.Analysis of haplotypes revealed a total of 23 hapltoyepes.Among them，H1(CAACG)，H2(CAATT)，H4(TGTTG)，H9(TGTTG)，H11(TATCG) and H16(CATCG) were unique or dominant in Chinese native chicken breeds，suggesting these haplotypes may be associated with the disease-resistant ability.

chicken；IL-2 gene；genetic diversity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.006

2014-06-09

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2012cj-5)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS04)

趙會(huì)靜(1978-)，女，河北石家莊人，助理研究員，碩士，主要從事畜禽遺傳資源分析研究，Tel：010-62815891，E-mail：zhhj1998927@163.com

*通信作者：趙桂蘋，研究員，E-mail:zhaoguiping@caas.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0041-09