閆曉剛，張芳毓，郎洪彥，金香淑，趙中利，劉 臣

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，公主嶺 136100)

人參莖葉多糖對(duì)雛雞小腸黏膜組織發(fā)育和免疫細(xì)胞的影響

閆曉剛，張芳毓，郎洪彥，金香淑，趙中利，劉 臣*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，公主嶺 136100)

為研究人參莖葉多糖(GSLP)對(duì)雛雞小腸黏膜組織發(fā)育和免疫細(xì)胞的影響，選擇600只體重相近(52.79±4.58 g)的7 日齡健康海蘭褐雛雞，隨機(jī)分為10個(gè)處理，每個(gè)處理60 只(3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只)，分為正常飼喂組和免疫抑制組，各包括5個(gè)處理，GSLP 添加量分別為0、0.2、0.4、0.8 和1.6 g·kg-1，試驗(yàn)期35 d。飼養(yǎng)期結(jié)束后，每個(gè)處理中隨機(jī)選擇9 只雛雞(每個(gè)重復(fù)3只)，采集空腸和回腸樣品。結(jié)果顯示：(1)GSLP提高了空腸絨毛寬度和表面積(P<0.01)，0.8 g·kg-1GSLP 降低空腸絨毛高度和隱窩深度(P<0.05)，0.8和1.6 g·kg-1GSLP降低回腸絨毛高度和隱窩深度(P<0.01)，GSLP 對(duì)絨腺比無(wú)顯著影響；(2)空腸絨毛高度(P<0.05)和黏膜厚度(P<0.01)以及回腸絨毛高度(P<0.05)中存在GSLP與免疫狀態(tài)之間的交互作用；(3)0.4、0.8 和1.6 g·kg-1GSLP 增加空腸CD3+陽(yáng)性細(xì)胞的面積(P<0.05)，1.6 g·kg-1GSLP提高空腸肥大細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)，GSLP對(duì)免疫細(xì)胞的作用存在劑量效應(yīng)。結(jié)果表明，GSLP 對(duì)小腸黏膜發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)養(yǎng)分吸收機(jī)能并無(wú)顯著影響；0.4～1.6 g·kg-1GSLP 提高空腸的黏膜免疫水平；GSLP對(duì)環(huán)磷酰胺前期抑制的空腸絨毛高度和黏膜厚度的發(fā)育具有改善作用。

人參莖葉多糖；蛋雛雞；小腸黏膜發(fā)育；免疫細(xì)胞

動(dòng)物腸道既是養(yǎng)分消化吸收的主要場(chǎng)所，也是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。完整和健康的腸道黏膜上皮結(jié)構(gòu)和腸道微生物是抵御病原體入侵的結(jié)構(gòu)屏障；腸道黏膜固有層內(nèi)的T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞(mast cell，MC)等免疫細(xì)胞及其分泌的免疫介質(zhì)構(gòu)成了腸道的免疫屏障[1-2]。

植物活性多糖對(duì)腸道黏膜發(fā)育和機(jī)體免疫機(jī)能具有廣泛的影響。有研究表明，黃芪多糖可以增加艾維茵肉仔雞小腸絨毛高度和寬度、黏膜厚度、絨腺比和絨毛表面積[3]。淫羊藿多糖和蘆薈多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞具有有絲分裂原樣作用，能促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能[4-5]。人參多糖對(duì)大鼠腸道黏膜淋巴細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，增加大鼠腸道派伊爾節(jié)淋巴細(xì)胞干擾素-γ(IFN-γ)的分泌水平[6-7]。人參莖葉是人參加工產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，水溶性多糖成分約占干重的10%以上，化學(xué)成分和藥理作用與人參根須基本相同，但是目前其開(kāi)發(fā)和利用并未受到足夠的重視。

幼齡動(dòng)物腸道健康狀況對(duì)全期生產(chǎn)性能表現(xiàn)具有重要的影響。因此，本項(xiàng)研究以正常和環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制海蘭褐蛋雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物，觀察人參莖葉多糖(Ginseng stem and leaf polysaccharide，GSLP)對(duì)不同免疫水平雛雞腸道黏膜組織發(fā)育和免疫細(xì)胞的影響，明確其對(duì)腸道黏膜發(fā)育和免疫的調(diào)節(jié)效果，從而為GSLP 在畜牧生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)動(dòng)物

GSLP 購(gòu)買(mǎi)于吉林省宏久生物科技股份有限公司，前期分析結(jié)果表明其多糖含量為24.4%，單糖組成為葡萄糖(48.8%)、半乳糖(15.6%)、甘露糖(12.4%)、阿拉伯糖(10.2%)、鼠李糖(7.7%)、半乳糖醛酸(3.1%)和木糖(2.2%)。

采用隨機(jī)化完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，600只7日齡海蘭褐蛋雛雞隨機(jī)分為10個(gè)處理，每個(gè)處理60只(3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只)，分為正常飼喂組和免疫抑制組，各包括5個(gè)處理。參考李相玲等研究結(jié)果[8]，試驗(yàn)期免疫抑制組雛雞按體重灌服100 mg·kg-1環(huán)磷酰胺，正常飼喂組灌服等量生理鹽水，連續(xù)7 d。正常飼喂組和免疫抑制組基礎(chǔ)日糧中GSLP 添加量分別為0、0.2、0.4、0.8和1.6 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)日糧

根據(jù)中國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)生長(zhǎng)蛋雞0～8周齡營(yíng)養(yǎng)需要配制試驗(yàn)日糧。試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雛雞每天7:00飼喂1次，自由采食和飲水，采用常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.4 樣品采集和分析

1.4.1 腸道組織 飼養(yǎng)期結(jié)束后，于早飼前分別從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇9只雛雞(每個(gè)重復(fù)3只)屠宰，采集空腸和回腸樣品，根據(jù)待測(cè)指標(biāo)的要求分別進(jìn)行標(biāo)記和保存。

1.4.2 小腸黏膜組織形態(tài) 試驗(yàn)雞空腸和回腸的前1/3處取2 cm腸段，用生理鹽水沖洗干凈并及時(shí)置于4%中性甲醛溶液固定。常規(guī)制備石蠟切片，厚度為6 μm。

小腸絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)采用蘇木素-伊紅(H.E.)染色，使用Leika 專(zhuān)用顯微鏡進(jìn)行觀察。利用Leika Application Suite 照相處理軟件和圖像分析系統(tǒng)測(cè)量空腸和回腸絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度。每個(gè)腸段取4張切片，每個(gè)切片選取3個(gè)最長(zhǎng)腸絨毛的高度及其相應(yīng)隱窩深度、絨毛寬度和肌層厚度進(jìn)行測(cè)量，取其平均值作為測(cè)定結(jié)果。絨腺比

表1 試驗(yàn)日糧組成(風(fēng)干基礎(chǔ))和營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table 1 Ingredient composition (air-dry basis) and nutrient levels (DM basis) of trial diet

日糧組成Dietcomposition比例/%Ratio營(yíng)養(yǎng)成分Nutrients含量/%Contents玉米Corn58.3干物質(zhì)Drymatter89.06豆粕Soybeanmeal25.9粗蛋白質(zhì)Crudeprotein19.84魚(yú)粉Fishmeal2.3粗脂肪Crudefat4.27大豆油Soybeanoil5.3總能/(MJ·kg-1)Grossenergy17.05玉米胚芽粕Corngermmeal2.0代謝能2/(MJ·kg-1)Metabolizableenergy11.94磷酸氫鈣CaHPO41.7粗纖維Crudefiber3.42石粉Limestone1.4粗灰分Ash5.79食鹽NaCl0.3無(wú)氮浸出物Nitrogenfreeextract55.75賴氨酸硫酸鹽Lysinesulphate0.3鈣Calcium1.09蛋氨酸Methionine1.5總磷Totalphosphorus0.71維生素和微量元素Vitaminsandtraceelements預(yù)混料1Premix1.0合計(jì)Total100

1.每千克預(yù)混料含維生素和微量元素：VA 500 kIU、VD3100 kIU、VE 1 000 IU、VK350 mg、 VB1180 mg、VB2360 mg、VB6350 mg、VB121 mg、煙酸 3 500 mg、泛酸 1 000 mg、葉酸 55 mg、生物素 15 mg、氯化膽堿 55 g、CuSO4·5H2O 3.0 g、FeSO4·H2O 25.0 g、ZnSO4·H2O 16.5 g、MnSO4·H2O 24 g、1%碘酸鈣 5.5 g、1% 亞硒酸鈉 3.3 g、1% 氯化鈷 0.4 g、NaHCO350 g。2.代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值和絨毛表面積計(jì)算公式如下：

1.Vitamins and microelements per kg of premix：VA 500 kIU，VD3100 kIU，VE 1 000 IU，VK350 mg，VB1180 mg，VB2360 mg，VB6350 mg，VB121 mg，Nicotinic acid 3 500 mg，Pantothenic acid 1 000 mg，F(xiàn)olic acid 55 mg，Biotin 15 mg，Choline chloride 55 g，CuSO4·5H2O 3.0 g，F(xiàn)eSO4·H2O 25.0 g，ZnSO4·H2O 16.5 g，MnSO4·H2O 24 g，1% Ca(IO3)25.5 g，1% Na2SeO33.3 g，1% CoCl20.4 g，NaHCO350 g.2.ME was a calculated value and others were measured values

絨腺比=絨毛高度/隱窩深度

絨毛表面積=2πrh，其中，r：小腸絨毛寬的1/2；h：小腸絨毛高度。1.4.3 小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(iIEL)數(shù)量 將上述用于觀察小腸黏膜組織形態(tài)的空腸和回腸組織切片進(jìn)行iIEL計(jì)數(shù)，方法為計(jì)數(shù)每100個(gè)上皮細(xì)胞內(nèi)的淋巴細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)樣品觀察5個(gè)視野，取其平均值，并按處理求平均值。

1.4.4 空腸黏膜CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積 空腸黏膜CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積采用免疫組織化學(xué)法(IHC)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)過(guò)程按照鼠Streptavidin-HRP試劑盒(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)操作。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉10 min，蛋白質(zhì)非特異結(jié)合位點(diǎn)封閉10 min，一抗(鼠抗雞)工作液孵育60 min，二抗(羊抗鼠IgG-Biotin)工作液孵育10 min，Streptavidin-HRP工作液孵育10 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(20×，北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水透明，中性樹(shù)脂封片。利用Leika Application Suite 照相處理軟件和圖像系統(tǒng)分析。每個(gè)處理選取5 張切片，每張切片選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)。

1.4.5 空腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量 采取空腸卵黃蒂處左右各約1 cm長(zhǎng)的腸段，用生理鹽水沖洗干凈并及時(shí)置于4%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)制備石蠟切片，高碘酸-西夫(PAS)染色。利用Leika 專(zhuān)用顯微鏡對(duì)上述空腸組織切片進(jìn)行杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)腸段取5根完整腸絨毛(400倍)，在腸絨毛上皮層，從腸絨毛的頂部依次向下計(jì)數(shù)100個(gè)柱狀細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)其中的杯狀細(xì)胞數(shù)量，取平均值，并按處理求平均值。

1.4.6 空腸上皮內(nèi)MC 數(shù)量 采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察空腸上皮內(nèi)MC數(shù)量，使用Leika專(zhuān)用顯微鏡計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法為將位于2個(gè)鄰近腸腺之間的腸絨毛劃為1個(gè)腸絨毛單位，計(jì)算10個(gè)完整腸絨毛單位固有層中的細(xì)胞數(shù)目，并求出每個(gè)絨毛單位的平均細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.2 Mixed程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，小腸黏膜組織形態(tài)和免疫細(xì)胞方差分析模型：

其中，Yijk為自變量ijk觀測(cè)值；μ為總平均效應(yīng)；ρi為GSLPi水平的效應(yīng)；αj為環(huán)磷酰胺j水平的效應(yīng)；(ρα)k為GSLPi水平與環(huán)磷酰胺j水平組合條件下的交互作用的效應(yīng)；eijk為ijk的隨機(jī)誤差分量。

采用SAS 9.2 PROC CCORR程序分析GSLP添加劑與小腸黏膜組織形態(tài)和免疫細(xì)胞的相關(guān)性。不同處理間的顯著性檢驗(yàn)利用Turkey-Kramer程序進(jìn)行多重比較，以P<0.01 為差異極顯著，P<0.05 為差異顯著；以P<0.10 為相關(guān)性顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小腸黏膜組織發(fā)育

與對(duì)照組相比，GSLP顯著提高了空腸絨毛寬度和絨毛表面積(P<0.01)，0.2和1.6 g·kg-1GSLP顯著提高回腸絨毛寬度(P<0.05)；但是0.8 g·kg-1GSLP顯著降低雛雞空腸絨毛高度和隱窩深度(P<0.05)，并且0.2、0.8和1.6 g·kg-1GSLP極顯著降低回腸絨毛高度(P<0.01)，0.8和1.6 g·kg-1GSLP極顯著降低回腸隱窩深度(P<0.01)。

不同添加劑量GSLP對(duì)小腸絨毛發(fā)育表現(xiàn)出了不同的作用效果，0.8 g·kg-1處理組空腸絨毛高度顯著低于0.4 g·kg-1處理組(P<0.05)，0.2 g·kg-1處理組回腸隱窩深度極顯著高于1.6 g·kg-1處理組(P<0.01)，0.4 g·kg-1處理組極顯著高于0.8 和1.6 g·kg-1處理組(P<0.01)，0.4 g·kg-1處理組回腸黏膜厚度顯著高于1.6 g·kg-1處理組(P<0.05)。

免疫抑制處理組空腸絨腺比顯著高于正常飼喂組(P<0.05)，而回腸絨毛高度和隱窩深度則極顯著低于正常飼喂組(P<0.01)。小腸絨毛完整性各處理間未觀察到顯著差異?？漳c絨毛高度(P<0.05)和黏膜厚度(P<0.01)以及回腸絨毛高度(P<0.05)中觀察到GSLP 添加水平與雛雞免疫狀態(tài)之間存在交互作用(表2，圖1～2)。

2.2 小腸黏膜免疫細(xì)胞

0.4、0.8和1.6 g·kg-1GSLP 處理組空腸CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積以及1.6 g·kg-1GSLP處理組MC數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表3)?？漳ciIEL 數(shù)量(R2=0.905 8)、CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積(R2=0.983 4)和MC數(shù)量(R2=0.984 5)以及回腸iIEL 數(shù)量(R2=0.887 6)隨GSLP 添加水平增加均呈現(xiàn)出二次曲線變化趨勢(shì)(表3，圖3～7)。

A～E.正常飼喂組，GSLP添加量依次為0、0.2、0.4、0.8、1.6 g·kg-1；F～J.免疫抑制組，GSLP 添加量依次為0、0.2、0.4、0.8、1.6 g·kg-1，下圖同A-E.Normal feeding treatment，additive levels of GSLP，in sequence，are 0，0.2，0.4，0.8，1.6 g·kg-1；F-J.Immuno depression treatment，additive levels of GSLP，in sequence，are 0，0.2，0.4，0.8，1.6 g·kg-1.The same as bellow圖1 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞空腸絨毛形態(tài)的影響(HE 染色)Fig.1 Effect of GSLP on jejunum morphology of 42 days chicken (HE staining)

正常飼喂和免疫抑制處理組之間免疫細(xì)胞數(shù)量差異并不顯著，并且各項(xiàng)指標(biāo)中未發(fā)現(xiàn)GSLP 添加水平與雛雞免疫狀態(tài)之間的交互作用。

2.3 相關(guān)性分析

空腸絨毛寬度(P<0.01)、黏膜厚度(P<0.05)、絨腺比(P<0.10)、絨毛表面積(P<0.01)和回腸絨毛寬度(P<0.05)，空腸iIEL(P<0.05)、CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積(P<0.01)、杯狀細(xì)胞(P<0.01)和MC 數(shù)量(P<0.01)與GSLP 呈正相關(guān)關(guān)系；空腸隱窩深度(P<0.10)、回腸絨毛高度(P<0.05)和隱窩深度(P<0.01)與GSLP 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4)。

表4 GSLP 與雛雞小腸黏膜組織發(fā)育和免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

Table 4 Correlation analysis between GSLP with small intestinal mucous development and immune cells of chicken

項(xiàng)目Item人參莖葉多糖GSLPP值 Pvalue空腸Jejunum絨毛高度/μmVillusheight0.01000.9256絨毛寬度/μmVilluswidth0.4058<0.0001隱窩深度/μmRecessdepth-0.18890.0746黏膜厚度/μmMucousthickness0.22570.0325絨腺比Villustoglandratio0.20010.0587絨毛表面積/μm2Villussurfacearea0.37980.0002回腸Ileum絨毛高度/μmVillusheight-0.23260.0274絨毛寬度/μmVilluswidth0.24350.0208隱窩深度/μmRecessdepth-0.37450.0003黏膜厚度/μmMucousthickness0.00980.9267絨腺比Villustoglandratio0.14090.1852絨毛表面積/μm2Villussurfacearea0.02840.7902空腸Jejunum淋巴細(xì)胞/(個(gè)·100細(xì)胞-1)Lymphocyte(Number/100cells)0.19800.0152CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積/μm2AreaofCD3+positivecells0.31040.0001杯狀細(xì)胞/(個(gè)·100細(xì)胞-1)Gobletcell(Number/100cells)0.22930.0048肥大細(xì)胞/個(gè)Mastcell(Number)0.29030.0003回腸Ileum淋巴細(xì)胞/(個(gè)·100細(xì)胞-1)Lymphocyte(Number/100cells)0.09900.2280

圖2 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞回腸絨毛形態(tài)的影響(HE 染色)Fig.2 Effect of GSLP on ileum morphology of 42 days chicken (HE staining)

圖3 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞空腸上皮淋巴細(xì)胞的影響(HE 染色，400×)Fig.3 Effect of GSLP on jejunum epithelium lymphocyte of 42 days chicken (HE staining，400×)

圖4 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞空腸CD3+ 陽(yáng)性細(xì)胞面積的影響(IHC，200×)Fig.4 Effect of GSLP on jejunum CD3+ positive cell area of 42 days chicken (IHC，200×)

圖5 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞空腸上皮杯狀細(xì)胞的影響(PAS 染色，400×)Fig.5 Effect of GSLP on jejunum epithelium goblet cell of 42 days chicken (PAS staining，400×)

圖6 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞空腸上皮肥大細(xì)胞的影響(甲苯胺藍(lán)染色，400×)Fig.6 Effect of GSLP on jejunum epithelium mast cell of 42 days chicken (Toluidine blue staining，400×)

圖7 GSLP 對(duì)42 日齡雛雞回腸上皮淋巴細(xì)胞的影響(HE 染色，400×)Fig.7 Effect of GSLP on ileum epithelium lymphocyte of 42 days chicken (HE staining，400×)

3 討 論

3.1 小腸黏膜組織發(fā)育

小腸黏膜組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性是保證飼養(yǎng)養(yǎng)分消化吸收和腸道黏膜免疫功能正常的基礎(chǔ)[9]。小腸絨毛表面積增加會(huì)提高飼料養(yǎng)分的吸收率，而絨腺比則反映了小腸的機(jī)能狀況，比值增加代表吸收機(jī)能的改善[10-11]。隱窩深度減小表明腸黏膜上皮細(xì)胞成熟率增加，其分泌功能相應(yīng)增強(qiáng)[12]。本試驗(yàn)中，GSLP通過(guò)增加空腸絨毛寬度和絨毛表面積，具有提高空腸吸收飼料養(yǎng)分的能力；并且低添加量(0.2 g·kg-1)和高添加量(1.6 g·kg-1)GSLP對(duì)回腸絨毛寬度的發(fā)育也表現(xiàn)出了積極的促進(jìn)作用。另外，不同GSLP 添加量對(duì)小腸絨毛高度和隱窩深度的作用效果并不一致?？傮w而言，高添加量(≥0.8 g·kg-1)GSLP在降低空腸和回腸隱窩深度，提高小腸黏膜腺體分泌機(jī)能的同時(shí)，對(duì)絨毛高度和黏膜厚度的發(fā)育具有負(fù)面作用。

空腸是飼料養(yǎng)分吸收的主要場(chǎng)所，隨著腸段的后移，腸絨毛逐漸變小，吸收和分泌功能逐漸減弱。GSLP中大部分多糖在空腸被吸收，其對(duì)腸道發(fā)育的有益作用表現(xiàn)為增加了空腸絨毛的寬度和表面積，這一結(jié)果與黃芪多糖對(duì)肉仔雞空腸絨毛發(fā)育的作用效果一致[3]。飼料黏度過(guò)高引起腸道滲透壓升高，導(dǎo)致絨毛分泌細(xì)胞增加，吸收細(xì)胞減少[13]。GSLP對(duì)回腸絨毛的發(fā)育存在劑量效應(yīng)，可能與GSLP促絨毛發(fā)育作用和GSLP 中可溶性非淀粉多糖黏性負(fù)面作用的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。0.2 g·kg-1GSLP處理組黏性相對(duì)較低，空腸未消化多糖對(duì)絨毛發(fā)育表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用；而1.6 g·kg-1GSLP黏性相對(duì)較高，導(dǎo)致空腸未消化多糖的比例增加，從而彌補(bǔ)了多糖黏性對(duì)回腸絨毛發(fā)育的不利影響。

高添加量GSLP 對(duì)隱窩深度、絨毛高度和黏膜厚度的影響同樣與其中可溶性非淀粉多糖(如半乳聚糖和甘露聚糖等)的黏性有關(guān)。GSLP 導(dǎo)致的黏性增加引起小腸滲透壓升高，相應(yīng)增加的分泌細(xì)胞和減少的吸收細(xì)胞則意味著隱窩深度減小，分泌機(jī)能增強(qiáng)以及絨毛高度和絨毛厚度的降低[10,12]。雖然不同添加量GSLP 對(duì)小腸絨毛各項(xiàng)發(fā)育指標(biāo)具有不同的作用效果，但是各處理間絨腺比差異并不顯著，表明GSLP 對(duì)雛雞小腸整體養(yǎng)分吸收機(jī)能并無(wú)明顯的影響。

試驗(yàn)前期灌服環(huán)磷酰胺對(duì)雛雞小腸組織的發(fā)育產(chǎn)生了后續(xù)的影響，抑制了試驗(yàn)后期小腸絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育，但是卻促進(jìn)了小腸黏膜上皮細(xì)胞的成熟，提高了腺體的分泌能力和消化機(jī)能。環(huán)磷酰胺誘發(fā)的免疫抑制可以提高胰島素水平，增加機(jī)體的合成代謝[14]。但是環(huán)磷酰胺的半衰期很短，通常為4～6 h，7 日齡連續(xù)灌服1周環(huán)磷酰胺對(duì)42日齡雛雞小腸分泌機(jī)能的影響是否和環(huán)磷酰胺提高機(jī)體合成代謝的作用有關(guān)，目前尚缺乏直接證據(jù)。

人參多糖可以對(duì)抗環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體免疫功能的恢復(fù)[15]。本研究中觀察到的交互作用表明GSLP對(duì)環(huán)磷酰胺所抑制的空腸絨毛高度和黏膜厚度的發(fā)育同樣具有改善作用。但是對(duì)于回腸絨毛高度，只有當(dāng)GSLP的添加劑量較高(1.6 g·kg-1)時(shí)才產(chǎn)生作用效果，這可能與不同腸段的消化吸收機(jī)能有關(guān)，空腸是養(yǎng)分的主要吸收?qǐng)鏊?，GSLP 中多糖大部分在空腸中被吸收，而回腸只是吸收機(jī)能的儲(chǔ)備。

3.2 小腸黏膜免疫細(xì)胞

人參多糖可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化，提高 T、B淋巴細(xì)胞的免疫活性，增強(qiáng)非特異性免疫系統(tǒng)功能[16-17]。GSLP多糖組成與人參根須基本相同，但是其對(duì)小腸黏膜免疫細(xì)胞的影響目前并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。iIEL具有抑制黏膜超敏反應(yīng)、中和外源細(xì)胞毒作用及分泌淋巴因子等多種功能，并且可以產(chǎn)生溶細(xì)胞活性，殺死或清除感染或損傷的上皮細(xì)胞，對(duì)細(xì)菌和病毒感染具有免疫監(jiān)視的作用[18-19]。CD3分子作為活化T 淋巴細(xì)胞的起始信號(hào)，在T淋巴細(xì)胞被抗原激活的早期過(guò)程起重要作用，是成熟T 淋巴細(xì)胞的特征性標(biāo)志，在一定程度上代表了T 淋巴細(xì)胞總數(shù)[20-21]。因此，小腸iIEL和CD3+T淋巴細(xì)胞反映了小腸的免疫狀態(tài)。本項(xiàng)研究中，GSLP 雖然對(duì)空腸和回腸iIEL 數(shù)量無(wú)明顯影響，但是當(dāng)GSLP添加量大于0.4 g·kg-1時(shí)，顯著增加了CD3+陽(yáng)性細(xì)胞的面積，表明GSLP具有促進(jìn)空腸黏膜中T淋巴細(xì)胞活化和增殖，提高細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用效果。另外，GSLP對(duì)空腸iIEL數(shù)量、CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積和回腸iIEL數(shù)量的作用存在著劑量效應(yīng)，當(dāng)添加劑量大于0.8 g·kg-1時(shí)，上述免疫細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

腸道黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞可以分泌黏蛋白，黏蛋白連續(xù)分布于腸道黏膜表面，形成疏水的黏液層，既可以保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受機(jī)械損傷，又可以包載抗原物質(zhì)從而利于胰腺分泌的酶進(jìn)行降解[22]。黏蛋白可以協(xié)同分泌型免疫球蛋白 A(SIgA)在腸黏膜表面形成抗感染的抗體黏膜屏障，利用腸蠕動(dòng)將捕獲的病原微生物和毒素清除體外[23]。GSLP雖然有增加空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但是試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異并不顯著。

MC是天然免疫的效應(yīng)細(xì)胞之一，其前體細(xì)胞位于腸黏膜固有層中，受到抗原刺激迅速分化成為成熟的MC，通過(guò)釋放免疫介質(zhì)使炎性細(xì)胞進(jìn)入黏膜參與獲得性免疫，在宿主對(duì)病原微生物的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24-25]。高添加量(1.6 g·kg-1)GSLP顯著增加了空腸MC的數(shù)量，而且添加量與MC數(shù)量呈二次曲線相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果表明GSLP可以增強(qiáng)小腸黏膜免疫調(diào)節(jié)機(jī)能，提高免疫力，而且同樣存在劑量效應(yīng)。GSLP 的劑量效應(yīng)可能與小腸T淋巴細(xì)胞有關(guān)，MC在增殖過(guò)程中普遍依賴于T淋巴細(xì)胞[26]，而本研究中CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積的變化在一定程度上反映了T淋巴細(xì)胞的變化趨勢(shì)。

3.3 相關(guān)性分析

雖然本項(xiàng)研究中各處理之間絨腺比的差異并不顯著，但是相關(guān)性分析結(jié)果表明GSLP 對(duì)小腸黏膜的發(fā)育仍然具有一定的促進(jìn)作用，并且對(duì)空腸黏膜發(fā)育的作用效果優(yōu)于回腸。另外，GSLP通過(guò)增加空腸iIEL數(shù)量和CD3+陽(yáng)性細(xì)胞面積，提高空腸的黏膜免疫水平。

4 結(jié) 論

多糖含量為24.4%的GSLP對(duì)蛋雛雞空腸和回腸黏膜組織的發(fā)育具有一定程度的促進(jìn)作用，但是對(duì)小腸養(yǎng)分吸收機(jī)能并無(wú)顯著的作用效果。不同添加量GSLP對(duì)免疫細(xì)胞作用存在劑量效應(yīng)，綜合GSLP對(duì)小腸黏膜免疫細(xì)胞的影響，0.4 ～1.6 g·kg-1GSLP可以提高空腸的黏膜免疫水平。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的雛雞前期免疫抑制可以促進(jìn)小腸黏膜上皮細(xì)胞的成熟，提高腺體的分泌機(jī)能。GSLP 對(duì)環(huán)磷酰胺前期抑制的空腸絨毛高度和黏膜厚度的發(fā)育具有改善作用。

[1] 張玉華，李樹(shù)友.斷奶仔豬腸道粘膜免疫及營(yíng)養(yǎng) [J].中國(guó)飼料，2002(1)：31-32. ZHANG Y H,LI S Y.Intestinal mucosal immunity and nutrition of weaned piglet[J].ChinaFeed,2002(1):31-32.(in Chinese)

[2] 姜厚濤，吳國(guó)華，張 強(qiáng)，等.動(dòng)物黏膜免疫的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(6)：655-660. JIANG H T,WU G H,ZHANG Q,et al.Advance in animal mucosal immunity[J].ChineseVeterinaryScience,2013,43(6):655-660.(in Chinese)

[3] 陶 浩，魏炳棟，陳 群.黃芪多糖對(duì)1～14 日齡肉仔雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(3)：52-57. TAO H,WEI B D,CHEN Q.Effect of polysaccharide on mocosal structure in small intestine of 14-day-old broilers[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2012，43(3)：52-57.(in Chinese)

[4] 蔣淑君，許蘭芝.淫羊藿總黃酮的藥理作用研究進(jìn)展 [J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，32(4)：60-62. JIANG S J,XU L Z.Study development of herba total flavonoids in pathology[J].ActaChineseMedicineandPharmacology,2004，32(4)：60-62.(in Chinese)

[5] 賈 敏，周玲玲，郭勝偉，等.蘆薈多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生IL-1 的影響 [J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(2)：89-90. JIA M,ZHOU L L,GUO S W,et al.Effect of polysaccharides in herba aloes on proliferation and formation of lymphocyte of mice spleen[J].JournalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,2006，22(2)：89-90.(in Chinese)

[6] 張皖東，呂 誠(chéng)，劉振麗，等.人參多糖和豬苓多糖對(duì)大鼠腸道黏膜淋巴細(xì)胞功能的影響[J].中草藥，2007，38(2)：221-224. ZHANG W D,Lü C,LIU Z L,et al.Effect of ginseng polysaccharide and polyporus umbellatus polysaccharide on function of lymphoeytes in enteric macosa of rats[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2007，38(2)：221-224.(in Chinese)

[7] 張皖東，呂 誠(chéng)，趙宏艷，等.人參多糖和豬苓多糖對(duì)CIA 大鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞功能的影響 [J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(9)：867-868,871. ZHANG W D,Lü C,ZHAO H Y,et al.Effect of ginseng polysaccharide and grifola polysaccharide on intestinal mucosal immane cell function of CIA rats[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology,2007，23(9)：867-868,871.(in Chinese)

[8] 李相玲，白莎莎，周 聯(lián)，等.環(huán)磷酰胺和地塞米松對(duì)小鼠腸道黏膜免疫抑制的比較 [J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2013，29(1)：39-42，47. LI X L,BAI S S,ZHOU L,et al.Comparison of the immunosupressive functions induced by cyclophosphamide and dexamethasone in intestinal mucosa in mice[J].ChineseJournalofImmunology,2013，29(1)：39-42，47.(in Chinese)

[9] HOUSHMAND M，AZHAR K，ZULKIFLI I，et al.Effects of non-antibiotic feed additives on performance，immunity and intestinal morphology of broilers fed different levels of protein [J].S.AfrJAnimSci，2012，42(1)：22-32.

[10] CASPARY W F.Physiology and pathophysiology of intestinal absorption [J].AmJClinNutr，1992，55(1)：299-308.

[11] 韓正康.家畜營(yíng)養(yǎng)生理學(xué) [M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：6-17. HAN Z K.Livestock nutritional physiology[M].Beijing:Agriculture Press,1993：6-17.(in Chinese)

[12] EWTUSHIK A L，BERTOLO R F P，BALL R O.Intestinal development of early-weaned piglets receiving diets supplemented with selected amino acids or polyamines [J].CanJAnimSci，2000，80(4)：653-662.

[13] LI D F，NELSSEN J L，REDDY P G，et al.Measuring suitability of soybean products for early-weaned pigs with immunological criteria [J].JAnimSci，1991，69(8)：3299-3307.

[14] 董曉芳，汪仕奎，薩仁娜，等.免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能及其內(nèi)分泌的影響 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(9)：993-998. DONG X F,WANG S K,SA R N,et al.Effect of immunosuppressant cyclophosphamide on performance and incretion in broiler[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2007，38(9)：993-998.(in Chinese)[15] 賈玉萍，周東順，孫 超，等.人參多糖對(duì)環(huán)磷酰胺的增效減毒作用 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21(6)：61-64. JIA Y P,ZHOU D S,SUN C,et al.Efficiency-enhancing and toxicity effects of ginseng polysaccharide on cyclophosphamide treatment of mouse hepatoma[J].ActaLaboratoriumAnimalsScientiaSinica,2013，21(6)：61-64.(in Chinese)

[16] YUN Y S，LEE Y S，JO S K，et al.Inhibition of autochthonous tumor by ethanol insoluble fraction from Panax ginseng as an immunomodulator [J].PlantaMed，1993，59(6)：521-524.

[17] KWAK Y，SHIN H，SONG Y，et al.Isolation of immunomodulatory antitumor active polysaccharide(RGAP) from red ginseng by-product and its physico-chemical properties [J].JKorenSocFoodSciNutr，2003，32：752-757.

[18] 謝遵江，劉文慶，賀業(yè)春，等.小鼠腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞在黏膜免疫應(yīng)答中的形態(tài)學(xué)研究[J].解剖學(xué)報(bào)，1997，28(3)：309-313. XIE Z J,LIU W Q,HE Y C,et al.Morphological study of mice intestinal intraepithelial lymphocytes in mucosal immune response[J].ActaAnatomicaSinica,1997，28(3)：309-313.(in Chinese)

[19] 范 駿.腸道黏膜免疫 [J].國(guó)際免疫學(xué)雜志，2006，29(2)：111-115. FAN J.Intestinal mucosal immunity[J].InternatimalJournalofImmunology,2006，29(2)：111-115.(in Chinese)

[20] 張洪濤.抗TCR/CD3單克隆抗體研究應(yīng)用的現(xiàn)狀與展望 [J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，1996，19(5)：239-243. ZHANG H T.Research and application development and prospect of anti-TCR/CD3 monoclonal antibody[J].ForeignMedicalSciencesSectionofImmunology,1996，19(5)：239-243.(in Chinese)

[21] 張小飛，楊 倩.復(fù)合黏膜免疫佐劑對(duì)雞小腸細(xì)胞免疫的影響 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(1)：85-90. ZHANG X F,YANG Q.Effects of compound mucosal immune adjuvants on cellular immune responses of small intestine in chicken[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2008，39(1)：85-90.(in Chinese)

[22] ATUMA C，STRUGALA V，ALLEN A，et al.The adherent gastrointestinal mucus gel layer：thickness and physical stateinvivo[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol，2001，280(5)：G922-G929.

[23] 羅治彬，吳嘉惠.腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展 [J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1997，6(4)：372-375. LUO Z B,WU J H.Research progress of intestinal mucosal barrier structure[J].ChineseJournalofGastroenterologyandHepatology,1997，6(4)：372-375.(in Chinese)

[24] ROCHA M F，AGUIAR J E，SIDRIM J J，et al.Role of mast cells and pro-inflammatory mediators on the intestinal secretion induced by cholera toxin [J].Toxicon，2003，42(2)：183-189.

[25] ROTTEM M，MEKORI Y A.Mast cells and autoimmunity [J].AutoimmunRev，2005，4(1)：21-27.

[26] HERSHKO A Y，RIVERA J.Mast cell and T cell communication；amplification and control of adaptive immunity [J].ImmunolLett，2010，128(2)：98-104.

(編輯 白永平)

Effects of Ginseng Stem and Leaf Polysaccharide on Small Intestinal Mucous Tissue Development and Immune Cells of Chicken

YAN Xiao-gang，ZHANG Fang-yu，LANG Hong-yan，JIN Xiang-shu，ZHAO Zhong-li，LIU Chen*

(TheBranchAcademyofAnimalScience，JilinAcademyofAgriculturalScience，Gongzhuling136100，China)

To study the effects of ginseng stem and leaf polysaccharide (GSLP) on small intestinal mucous tissue development and immune cells of chicken，600 of 7 days healthy Hy-line Variety Brown chicken (52.79±4.58 g) were freely divided into 10 treatments，60 chicken per treatment (3 replications，20 chicken per replication)，5 treatments were included in normal fed group and others were in immune depressed group.The additive levels of GSLP were 0，0.2，0.4，0.8 and 1.6 g·kg-1in each group based on basal diet.After feeding stage，9 chicken of each treatment (3 per replication) were randomly selected for samples collection of jejunum and ileum.The results showed that：(1) GSLP improved villus width and surface area of jejunum (P<0.01)，0.8 and 1.6 g·kg-1GSLP decreased villus height and recess depth of ileum (P<0.01)，but GSLP had no significant effects on villus to gland ratio；(2) The interactions of GSLP with immune state were observed in jejunum villus height (P<0.05) and mucous thickness (P<0.01)，and ileum villus height (P<0.05)；(3) 0.4，0.8 and 1.6 g·kg-1GSLP increased the amounts of CD3+T lymphocyte(P<0.05)，and 1.6 g·kg-1GSLP increased the amounts of mast cell (P<0.05) in jejunum，and dosage effects were existed in the influence of GSLP on immune cells.In conclusion，GSLP had somewhat improvement on small intestinal mucous tissue development，but had no significant influence on nutrients absorptive function；0.4 to 1.6 g·kg-1GSLP increased the level of jejunum mucous immunization；and GSLP could improve the development of jejunum villus height and mucous thickness depressed by cyclophosphamide in early trial stage.

ginseng stem and leaf polysaccharide；egg laying chicken；small intestinal mucous development；immune cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.019

2014-05-01

吉林省博士后科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目；吉林省現(xiàn)代家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

閆曉剛(1977-)，男，吉林臨江人，副研究員，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控研究，E-mail：yanxiaogang1977@163.com，Tel:0434-6282058

*通信作者：劉 臣，研究員，E-mail:liuchen3199@163.com

S831.5

A

0366-6964(2015)01-0144-12