卜凡亮　宋明　河南省濟(jì)源市畜牧局動物衛(wèi)生監(jiān)督所　459000

BVDV河南分離株人工感染家兔試驗(yàn)

卜凡亮宋明河南省濟(jì)源市畜牧局動物衛(wèi)生監(jiān)督所459000

為了了解牛病毒性腹瀉病毒河南分離株對家兔的致病性，采用腹腔注射方法感染家兔，通過體溫測定、臨床觀察1周后剖殺，采用RT-PCR技術(shù)對血清、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和腸黏膜進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，家兔對牛病毒性腹瀉病毒河南分離株的感染不呈現(xiàn)明顯癥狀，牛病毒性腹瀉病毒分離株對家兔無明顯致病變影響。

1　材料與方法

（1）試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間。本試驗(yàn)于2013年3月24日至5月3日在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

（2）試驗(yàn)材料。從鄭州市某養(yǎng)殖場購入5只1月齡左右、體重約0.3kg的斷奶家兔，臨床各項(xiàng)指標(biāo)正常，精神狀態(tài)良好，BVDV糞便PCR檢測陰性。分籠標(biāo)記后喂以全價(jià)顆粒飼料，自由采食和飲水，隔離飼養(yǎng)1周，每天上、下午各測體溫1次，對健康者進(jìn)行試驗(yàn)觀察。毒株與細(xì)胞株為牛病毒性腹瀉病毒Oregon C24V株，購買于中國獸醫(yī)監(jiān)察所，在本試驗(yàn)中做標(biāo)準(zhǔn)對照株；BVDV-MQ01分離株為本次待測株，由寄生蟲學(xué)試驗(yàn)室分離保存。胎牛腎細(xì)胞（MDBK）來源于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。主要試劑為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Premix EX Taq DNA聚合酶、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、新生馬血清、EDTA、胰蛋白酶，主要儀器為TGL-16B高速臺式離心機(jī)、PTC-200型PCR儀、DYY-Ⅲ-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀、UV-2000紫外分析儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)。

（3）試驗(yàn)方法。迅速地從液氮中取出凍存含有MDBK細(xì)胞的凍存管，立即將凍存管放入42℃水浴中快速溶化，然后將含有細(xì)胞凍存懸液的凍存管移入離心管中，1000r/min離心5min，棄上清液。將細(xì)胞沉淀物移入含有6~8mL完全培養(yǎng)基（含馬血清10%）的培養(yǎng)瓶(25mL培養(yǎng)瓶)，置于CO2培養(yǎng)箱（5.0%CO2，37℃）培養(yǎng)24~48h，觀察細(xì)胞的生長情況。取長成單層MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，棄去原培養(yǎng)液，接種OregonC24和BVDV-MQ01的病毒細(xì)胞培養(yǎng)液約1mL，吸附1h后棄去病毒液，加入6mL細(xì)胞維持液（含有馬血清2%~3%）培養(yǎng)，間隔24h觀察1次。對照組用不接種病毒的細(xì)胞。維持培養(yǎng)72～96h收毒，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將病毒樣品作10倍系列稀釋，接種至已鋪滿MDBK細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)板中，每稀釋度接種8孔，37℃吸附1h后，按0.1mL/孔加入含2%馬血清的細(xì)胞維持液，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察記錄細(xì)胞病變情況，96h后進(jìn)行判斷，采用Reed-Muench法測定純化BVDV的毒價(jià)。TCID50的對數(shù)=高于50%病毒稀釋對數(shù)-相應(yīng)距離比×稀釋系數(shù)的對數(shù)（10倍遞進(jìn)稀釋時(shí)為1）。距離比例=1.3.3病毒的濃縮與純化，采用PEG濃縮法對所收獲的病毒液進(jìn)行濃縮。取反復(fù)凍融3次各代次合并后的細(xì)胞毒，2000～3000rmp離心15min，取上清液。將上清液裝入處理好的透析袋內(nèi)，用PEG-6000包埋透析袋，4℃作用數(shù)小時(shí)。待透析袋內(nèi)的液體量濃縮至原來的1/5～1/10時(shí)將其吸出，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別用滅菌生理鹽水（含雙抗）將兩種純化病毒稀釋至10mL。對照組1只，編號1號，采取腹腔注射2mL含雙抗的滅菌生理鹽水；試驗(yàn)組4只兔子，編號2~5號，編號為2號和3號的兔子采用腹腔注射分別注入BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株2mL，編號為4號和5號的兔子采取同樣的方法分別注入BVDV河南分離株2mL，接種后每天于下午4點(diǎn)測1次體溫，記錄數(shù)據(jù)。

接種后每天采集糞便，冷凍備用，于攻毒后7天剖殺，無菌采取脾臟和淋巴結(jié)置-70℃保存?zhèn)溆茫恍呐K采血分離血清，置-20℃保存。將組織樣品無菌操作放入滅菌平皿中，用含雙抗的Hank’s液洗滌3次，剔除組織被膜上所附著的脂肪等結(jié)締組織，將組織樣品置乳缽中，剪碎。剪碎后的脾臟組織碎塊移入200mL燒杯中，按一定比例加入Hank’s液（含雙抗）后勻漿10000r/min離心2min，吸取組織勻漿液于250mL試劑瓶中，-20℃保存。反復(fù)凍融3次后，以2000r/min離心15min，吸取上清液，分裝入15mL試劑瓶內(nèi)，-20℃保存。采取RT-PCR方法對所采取的病料進(jìn)行檢測。

病料的RT-PCR檢測。(1)引物的設(shè)計(jì)合成。根據(jù)GenBank的公布的BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Oregon C24V及其他株的5'-UTR保守區(qū)設(shè)計(jì)引物對F和R，該引物擴(kuò)增出長度為285bp片段，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。(2)病毒RNA的提取。按照invitrizol公司Trizol說明書提取病料中RNA。(3)反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。以RNA為模板，用一擴(kuò)下游引物F2與R2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，首先將RNA和下游引物F2、R2混合，70℃水浴10min，冰浴5min，然后加入其他成分。42℃水浴1h，70℃水浴15min。用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。(4)PCR擴(kuò)增cDNA。以cDNA為模板，分別用引物對F1-F2和R1-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)按25μL體系進(jìn)行。(5)瓊脂糖凝膠電泳檢測。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的片段的擴(kuò)增結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1攻毒前BVDV毒價(jià)測定結(jié)果

(1)攻毒前采用Reed-Muench法測定純化。BVDV標(biāo)準(zhǔn)株與分離株BVDV-MQ01的TCID50分別為10~ 5.465與10~6.5TCID50/mL。

(2)攻毒后家兔臨床表現(xiàn)情況。攻毒后2天內(nèi)家兔食欲略有減少，飲欲增加，活動減少，糞便無明顯變化，兩天后即恢復(fù)正常。

（3）攻毒后家兔體溫的變化。家兔攻毒后3天內(nèi)體溫均有不同程度的升高，最高體溫升高到40.8℃，體溫上升幅度最小的也至40℃，且標(biāo)準(zhǔn)毒株組的體溫變化比分離組升高明顯。4天后試驗(yàn)組家兔體溫均恢復(fù)正常，直至處死，體溫一直處于正常狀態(tài)。整個(gè)試驗(yàn)過程中對照組家兔體溫正常。分別將實(shí)驗(yàn)組4只兔子的體溫與對照組做統(tǒng)計(jì)分析（t檢驗(yàn)），其P值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05，表明BVDV可以導(dǎo)致家兔短期內(nèi)體溫出現(xiàn)升高，但是整體來說升高幅度并不顯著。

（4）實(shí)驗(yàn)組家兔剖檢臟器病變情況。通過對攻毒1周后的試驗(yàn)兔剖檢觀察，發(fā)現(xiàn)各臟器無明顯病變。

（5）RT-PCR結(jié)果。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig2 the resuIt of RT-PCR expands increase P陽性對照，血清、淋巴結(jié)、脾臟、糞便、腸黏膜，N陰性對照，5種病處理后經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，用BVDV OregonC24標(biāo)準(zhǔn)毒株作為陽性對照，經(jīng)凝膠電泳后均得到一條大小為285bp的特異性條帶，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段相符。表明試驗(yàn)采集的病料中均含有BVDV河南分離株病毒，人工感染成功。

3　結(jié)論與討論

（1）BVDV與CSFV接種家兔后的異同。BVDV 與CSFV同屬瘟病毒屬，血清學(xué)檢測已證明兩者在抗原上有相似性，二者間有較近的親緣關(guān)系。CSFV攻毒家兔可以產(chǎn)生定型熱，而本試驗(yàn)結(jié)果表明，BVDV攻毒家兔后雖有體溫變化，但是未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)。鄧宇等用耳緣靜脈的方法將BVDV Oregon C24標(biāo)準(zhǔn)毒株感染3kg左右家兔，研究了BVDV對家兔致病性表現(xiàn)，結(jié)果顯示家兔攻毒后6h體溫有升高，6h后即恢復(fù)正常。本試驗(yàn)中家兔0.3kg左右，腹腔注射接毒4天后體溫才恢復(fù)正常。這一結(jié)果表明，家兔對同一BVDV毒株反應(yīng)的差異可能與所在發(fā)育階段、接種方式和不同的環(huán)境變化刺激（溫度、飼養(yǎng)環(huán)境）有關(guān)。

（2）BVDV對不同動物的感染結(jié)果。BVDV的主要感染宿主為牛、羊、豬、鹿。實(shí)驗(yàn)條件下，大多數(shù)感染豬臨床上觀察不到明顯的癥狀，呈亞臨床感染；羊、兔均能產(chǎn)生不具有臨床表現(xiàn)的帶毒狀態(tài)。BVDV感染家兔后除了體溫變化并無特征性臨床癥狀和明顯剖檢病變。

（3）BVDV標(biāo)準(zhǔn)株和分離株人工感染家兔結(jié)果。BVDV的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株人工感染家兔后，臨床表現(xiàn)和剖檢結(jié)果無明顯區(qū)別，但標(biāo)準(zhǔn)株比分離株引起體溫升高明顯，由接種前毒價(jià)的測定可知，是由于BVDV標(biāo)準(zhǔn)株毒價(jià)高于河南分離株。因?yàn)闀r(shí)間有限，本實(shí)驗(yàn)沒有做病理切片進(jìn)行觀察，是否會造成一定的病理變化，還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

（4）RT-PCR在牛病毒性腹瀉病檢測中的應(yīng)用。目前，研究人員建立了很多種方法用于BVDV的檢測，如病毒分離、電鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法等。本試驗(yàn)通過對儀器設(shè)備及試驗(yàn)?zāi)康木C合考慮，最終采用RT-PCR方法進(jìn)行檢測。RTPCR技術(shù)經(jīng)濟(jì)、快速、敏感、特異，可以在實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)調(diào)查上大量推廣使用。