強 俊 楊 弘, 馬昕羽 王 輝 徐 跑,① 何 杰 朱志祥

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室 無錫 214081;2. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院 無錫 214081; 3. 淮陰師范學院生命科學學院 淮安 223300)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖中集約化水平的提高, 高密度高投餌的養(yǎng)殖方式造成了高蛋白殘餌和高含氮排泄物的增加(Parket al, 2007)。水體中的硝化細菌可以將氨氮氧化成可以轉(zhuǎn)化為(Camargoet al,2005)。與NO3相比,對魚體的毒性較大(Holtetal, 1983)。在低密度養(yǎng)殖中, 水中的含量一般較低(0.03—0.1mg/L)(Siikavuopioet al, 2006), 然而, 近年來的高密度養(yǎng)殖方式可能導致水環(huán)境中含量的增加, 魚體血液和組織中濃度是水環(huán)境中的10—100 倍(Da Costaet al, 2004)。在機體中能夠轉(zhuǎn)化為一些有毒的衍生物, 使魚體生理功能產(chǎn)生紊亂, 進而阻礙生長與存活(Svobodováet al, 2005)。De lima等(2011)研究發(fā)現(xiàn), 水中的濃度低于1.19mg/L對鯰魚(Rhamdia quelen)的特定生長率與存活率無顯著影響; 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)暴露在中28d后, 生長和存活與對照組相比無顯著差異, 而濃度為3.0 mg/L時, 體重下降, 存活率為65% (Kroupovaet al, 2008)。Deane等(2007)研究發(fā)現(xiàn), 將平鯛(Sparus sarba)放置在不同濃度(0, 25, 50mg/L)下 7d, 隨濃度上升, 肝臟指數(shù)增加, 血清 T4含量下降、T3含量不變,脅迫對血清中 K+和 Na+含量無影響, 但可提高鰓絲中Na+-K+ATPase活力; Park 等(2007) 鲉發(fā)現(xiàn)無備平(Sebastes inermis)在700mg/L濃度下脅迫 96h,皮膚、鰓絲、肝臟與腎臟組織發(fā)生非正常組織學變化,總紅細胞數(shù), 血紅蛋白以及血清蛋白含量也顯著下降。關(guān)于對羅非魚影響的研究主要集中在急性脅迫對其存活與生化指標的影響方面(Atwoodet al, 2001; Wanget al, 2006; Yildizet al, 2006)。

養(yǎng)殖密度是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)力和水產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。隨著我國南方地區(qū)羅非魚集約化養(yǎng)殖的大規(guī)模發(fā)展, 合理地增加養(yǎng)殖密度有助于提高水體利用與養(yǎng)殖效益。然而, 魚類種群數(shù)目增加可能對其生存空間與攝食產(chǎn)生影響, 引起擁擠脅迫(Monteroet al, 1999),影響?zhàn)B殖群體生長率和存活率(馬愛軍等, 2005; Merinoet al, 2007)。同時高密度集約化養(yǎng)殖也會增加水環(huán)境中氨氮、亞硝酸鹽等有毒物質(zhì)含量, 影響機體的免疫力,增加魚病發(fā)生的幾率(王文博等, 2004; Ngaet al, 2005)。

已有研究發(fā)現(xiàn), 養(yǎng)殖密度與水環(huán)境因子對水生動物生長、存活(Salama, 2005)以及生化指標(董曉煜等, 2008)存在聯(lián)合影響。養(yǎng)殖密度與水環(huán)境因子之間是相互聯(lián)系、相互制約的關(guān)系。本實驗主要研究了不同養(yǎng)殖密度下, 慢性亞硝酸鹽脅迫對吉富羅非魚幼魚生長與肝臟抗氧化力的影響, 利用響應(yīng)曲面法分析了因子間可能的二次效應(yīng)與互作效應(yīng), 建立了相關(guān)的曲面模型。本研究對保障羅非魚集約化養(yǎng)殖高產(chǎn)、高效、安全、健康, 實現(xiàn)羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗開始前將吉富羅非魚幼魚放置于室內(nèi)4.2m3水泥池中暫養(yǎng) 8d, 暫養(yǎng)條件為水溫(28±0.5)°C), pH 7.4±0.2, 亞硝酸鹽低于0.01 mg/L, 溶氧高于5mg/L。暫養(yǎng)期間每天投喂膨化飼料2次(8: 00和15: 00), 飼料中粗蛋白含量為28%, 粗脂肪為6%。

1.2 實驗設(shè)計與分組

正式實驗開始前, 采用預(yù)實驗分析實驗魚正常生長的亞硝酸鹽范圍。本實驗運用中心復合實驗設(shè)計(Central Composite Rotatable Design: CCD), 以亞硝酸鹽(0.02—2.8mg/L)與養(yǎng)殖密度(1—5尾/10L)為實驗考察因子, 分別以N和D表示。實驗組合見表1, 實驗中每個組合重復3次。特定生長率(specific growth rate: SGR)和肝臟SOD、CAT活力與MDA含量為本實驗的響應(yīng)值, 具體的編碼水平與實際值見表1。

表1 實驗設(shè)計組合和結(jié)果Tab.1 Experimental design of nitrite and density and results (Mean±SD)

1.3 養(yǎng)殖管理

選取39個容積為1200L的塑料養(yǎng)殖桶, 每個桶1000L自來水, 曝氣3d后使用。本實驗中采用NaNO2調(diào)節(jié)水中亞硝酸鹽濃度, 實驗開始前先配制4.93 g/L的亞硝酸鹽母液。實驗中每隔4h調(diào)節(jié)水中亞硝酸鹽濃度一次, 檢測方法按照Chen等(2000)。實驗用魚的馴化采用漸進方式, 每天水中亞硝酸鹽濃度增加0.2—0.3 mg/L, 分別馴化至實驗所需濃度(0.02, 0.43,1.41, 2.39和2.8 mg/L), 在此亞硝酸鹽濃度下馴養(yǎng)10d左右, 吉富羅非魚可以正常攝食與活動后開始實驗。實驗期間采用恒溫加熱棒控溫在(28±0.5)°C, pH 7.6±0.2。 實 驗 用 魚 體 重 為 (2.97±0.06)g, 體 長 為(4.45±0.12)cm, 將表 1的養(yǎng)殖密度: 1、1.59、3、4.41和 5尾/10L)轉(zhuǎn)換為實際魚數(shù)為 100、159、300、441和500尾/m2, 實驗共需11700尾魚, 各實驗組合魚體均重無顯著差異(ANOVA,P>0.05)。飼料投喂量為體重的4%—6%。實驗期間連續(xù)充氣, 每隔3d換水1/3, 換水前后溫差不超過±0.5°C, 自然光周期。未添加亞硝酸鹽前的實驗用水中總氨氮 0.02mg/L, Cl–16mg/L。

1.4 響應(yīng)值測定

取樣前停飼24h, 每個實驗組合隨機挑選20尾魚測量體重, 特定生長率(SGR) (%/d) = [(lnW2–lnW1)/(t2–t1)] ×100。式中,W1、W2分別為起始時間t1、終末時間t2時的體重(g)。

每個養(yǎng)殖桶隨機取5尾魚, 取0.1g左右的肝臟用液氮速凍后, 于–70°C保存, 用于酶活與MDA分析。用預(yù)冷生理鹽水沖洗解凍后的肝臟樣品, 濾紙吸干水分, 分析天平稱重后加入 4倍體積(W/V)預(yù)冷生理鹽水, 使用勻漿器研磨制勻漿, 粗酶液置于4°C保存, 在24h內(nèi)測定完畢。肝臟組織中丙二醛(Malondialdehyde:MDA)含量測定參照 Xiang等(1990); 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase: SOD)含量測定參照ōyanagui(1984); 過氧化氫酶(Catalase: CAT)含量測定參照 Sinha(1972); 蛋白質(zhì)采用 Felin-酚試劑法(Lowryet al, 1951), 試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理與模型建立

本實驗中的測定結(jié)果用平均值±標準差(Mean±Standard diversion)表示。實驗設(shè)計與結(jié)果處理采用STATISTICA 8.0軟件, 通過最小二乘法擬合因子與響應(yīng)值之間的二次多項回歸模型為:

式中, ?Y為響應(yīng)預(yù)測, 在此響應(yīng)指標為SGR、MDA、SOD 和 CAT;b0、b1、b2、b3、b4、b5, 分別為回歸常數(shù)、N與D的一次效應(yīng)、N與D間互作效應(yīng)、N與D的二次效應(yīng)。顯著水平P<0.05, 極顯著水平P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽(N)與養(yǎng)殖密度(D)對吉富羅非魚幼魚SGR的影響

將表1中SGR結(jié)果采用最小二乘法進行回歸擬合, 結(jié)果列于表2?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗中N、D、D×N和N2和D2對SGR均有顯著影響(P<0.05)(表2)。同時, 由表2回歸系數(shù)可見, 在對SGR影響效應(yīng)上,N占主效應(yīng)。D和N與SGR之間模型為(1):

N和D與SGR之間的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖1(a和b)。本實驗條件下, 隨著水環(huán)境中N升高,SGR基本在6.90%/d; 然而,N高于0.70mg/L時, SGR呈下降趨勢(P<0.05); SGR隨D的增加呈先上升后下降的趨勢。D為2.03—2.36尾/10L,N為0.43—0.48mg/L時, SGR介于7.26—7.29%/d。

表2 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Tab.2 Test of significance for regression coefficient

圖1 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚特定生長率影響的響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.1 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on SGR in GIFT tilapia juvenile

2.2 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA含量的影響

采用最小二乘法對表1的MDA數(shù)據(jù)進行回歸擬合, 分析結(jié)果列于表3。D和N對MDA有極顯著影響(P<0.01),D2、N2和D×N對 MDA 沒有顯著影響(P>0.05)(表 3); 在對 MDA的影響效應(yīng)上,D較為顯著?；貧w模型為(2):

由圖2可見, MDA含量隨著N與D的增加而上升。當N為1.41mg/L,D為1尾/10L時, 幼魚肝臟MDA含量為0.67nmol/mgprot; 高密度刺激了肝臟MDA含量的增加,D為5尾/10L, MDA含量達到0.96nmol/mg prot。

2.3 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟SOD活力的影響

SOD回歸分析結(jié)果見表4。D、D2和N2對SOD有極顯著影響(P<0.01), 而N與D×N對SOD也有顯著影響(P<0.05)(表4); 回歸系數(shù)顯示,D對SOD的效應(yīng)較N明顯。回歸模型為(3):

本實驗條件下, 當D為3尾/10L時, SOD活力隨水環(huán)境中N濃度增加(從0.02 mg/L到1.50mg/L)而上升; 然而, 隨著N濃度繼續(xù)上升(>1.50mg/L), SOD活力顯著降低(P<0.05)(圖3); 同時,N為1.63 mg/L,D為2.55尾/10L時, 肝臟SOD活力為105.46 U/(mg prot),其可靠性為0.918。

2.4 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟CAT活力的影響

CAT活力擬合與顯著性檢驗結(jié)果見表5?；貧w模型極顯著(P<0.01); 失擬項P=0.1186>0.05, 模型有效。N,D和D×N對CAT活力有顯著影響(P<0.05),N2與D2對CAT活力有極顯著影響(P<0.01)(表5); 回歸系數(shù)顯示,N與D對CAT活力的影響無明顯差異。D、N與CAT活力之間的實際二次回歸模型(4):

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Tab.3 Test of significance for regression coefficient

圖2 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA含量影響的響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.2 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on hepatic MDA contents in GIFT tilapia juvenile

圖3 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚超氧化物歧化酶活力影響的響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.3 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on hepatic SOD activities in GIFT tilapia juvenile

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Tab.4 Test of significance for regression coefficient

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Tab.5 Test of significance for regression coefficient

本實驗條件下,D為3尾/10L, 肝臟CAT活力隨水中N濃度的增加(從0.02mg/L上升為1.35mg/L)而上升; 然而, 水環(huán)境中N高于1.35mg/L時, 羅非魚肝臟CAT活力呈下降趨勢(圖4);D對CAT活力的影響與SOD相似。當D為3.19尾/10L,N為1.20 mg/L時,CAT活力為45.17 U/(mg prot), 其可靠性為0.929。

3 討論

在含氮化合物中, 氨氮與亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中主要的污染物。水環(huán)境中亞硝酸鹽的毒性依據(jù)實驗條件的不同以及生物個體的特點, 在不同魚類中差異較大, 這就給比較不同魚類對于亞硝酸鹽的敏感程度帶來了困難。紅肚鯧魚(Colossoma macropomum)在急性亞硝酸鹽脅迫下96h的半致死濃度為0.54mg/L, 顯示對亞硝酸鹽脅迫極為敏感(Da Costaet al, 2004); 虹鱒在溫度為 14.0—15.5°C時, 96h的半致死濃度為11.2mg/L, 而在10.0°C時僅為0.24mg/L(Russoet al,1977); 鮭類對亞硝酸鹽的耐受性可達 140mg/L(Russoet al, 1977)。本研究中, 在亞硝酸鹽濃度不同、其它水環(huán)境因子基本相同的條件下, 比較了水中 Cl–濃度為16 mg/L時, 不同養(yǎng)殖密度下慢性亞硝酸鹽脅迫對吉富品系尼羅羅非魚生長與肝臟抗氧化因子的影響。

3.1 亞硝酸鹽與養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚生長的影響

圖4 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚過氧化氫酶活力影響的響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.4 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on CAT activities in GIFT tilapia juvenile

亞硝酸鹽能直接或間接影響魚類的生長和生存,其對魚類的毒害作用會嚴重制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。亞硝酸鹽對淡水生物的毒性遠高于海洋生物, 可能是因為海水中有較高的氯化物濃度以及對滲透壓調(diào)節(jié)能力的不同(Jensen, 2003)。本實驗中, 吉富羅非魚不同實驗組合下飼養(yǎng)35d后, 養(yǎng)殖密度為3尾/10L時,亞硝酸鹽濃度為 0.02mg/L的實驗組, 幼魚的特定生長率是2mg/L組的1.82倍。Frances等(1998)研究發(fā)現(xiàn)石首魚(Bidyanus bidyanus)在水中亞硝酸鹽濃度低于 16.2mg/L時, 不會引起死亡; 而濃度高于 1.43mg/L時, 25d后, 其生長速度顯著降低。Siikavuopio等(2006)研究發(fā)現(xiàn), 大西洋鱈魚(Gadus morhua)在0—5mg/L的亞硝酸鹽濃度的水環(huán)境中, 31d后, 生長速度隨濃度升高而降低, 但對攝食率無明顯影響。本研究中發(fā)現(xiàn), 當亞硝酸鹽濃度高于 0.7mg/L時, 幼魚的生長率顯著下降。血紅蛋白中的Fe2+可以通過水體的亞硝酸鹽氧化為 Fe3+, 從而產(chǎn)生高鐵血紅蛋白, 由于高鐵血紅蛋白缺乏運輸氧氣的能力, 因而血液的載氧能力降低, 呼吸機能下降, 造成組織缺氧(Jensen,2003)。魚體需要更多能量來加快自身解毒功能, 魚類活動能力會增強, 呼吸頻率加快, 耗氧率上升(Mallasenet al, 2006), 因而用于生長的將會減少。與本實驗結(jié)論相反, Kamstra等(1996)研究發(fā)現(xiàn), 隨著水中亞硝酸鹽濃度升高, 50d后, 高濃度實驗組歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)的死亡率較高, 但亞硝酸鹽對其生長與飼料利用無顯著影響, 可能是因為各組魚的死亡引起密度差異或其它環(huán)境因子的復合影響, 導致無法更加有效的解釋其生長數(shù)據(jù)。

Kebus等(1992)認為, 高養(yǎng)殖密度抑制魚類生長主要是由于高負載造成水質(zhì)惡化引起的。本實驗中,除了水中亞硝酸鹽濃度不同外, 其它各項水環(huán)境指標均在羅非魚正常生長的范圍之內(nèi)。實驗中發(fā)現(xiàn), 適當?shù)奶岣唣B(yǎng)殖密度可能會刺激羅非魚的能量代謝,通過提高外源食物的獲取, 在一定程度上促進羅非魚的生長。然而, 隨著密度的增加, 高養(yǎng)殖密度對羅非魚產(chǎn)生了生理應(yīng)激, 動員體內(nèi)更多的能量來彌補應(yīng)激對能量的額外需求, 從而導致用于生長的能量減少(Qianget al, 2013), 對生長產(chǎn)生了抑制作用。

3.2 亞硝酸鹽與養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA、SOD與CAT指標影響

通常, 氧化系統(tǒng)中特異酶活表達水平或活力的變化可以用于環(huán)境脅迫時機體氧化應(yīng)激的生物指標(強俊等, 2012)。本實驗中, 慢性亞硝酸鹽脅迫改變了羅非魚肝臟MDA含量和CAT與SOD的活力。亞硝酸鹽濃度為 1.35—1.41mg/L時, 肝臟中較高的 SOD與 CAT活力可能與魚體增加代謝來適應(yīng)環(huán)境脅迫,減輕脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。然而, 當水環(huán)境中的亞硝酸鹽濃度高于羅非魚自身的耐受范圍時, MDA含量隨著氧自由基積累而增加(強俊等, 2011)。隨著亞硝酸鹽濃度繼續(xù)上升, 魚體的SOD與CAT活力明顯下降,可能是細胞代謝發(fā)生一定程度的改變而不是氧化應(yīng)激的結(jié)果(Martínez-álvarezet al, 2002)。Wang 等(2004)研究發(fā)現(xiàn), 日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在半致死亞硝酸鹽濃度下脅迫24h, SOD、CAT與GPx活力分別下降了67%、80.6% 和82.7%。本研究中發(fā)現(xiàn), 羅非魚肝臟SOD與CAT活力對水環(huán)境中亞硝酸鹽的波動較為敏感, 可用作評估其面對亞硝酸鹽應(yīng)激時的良好指示物。

魚類工廠化養(yǎng)殖中, 較高的水體亞硝酸鹽濃度通常與高密度的養(yǎng)殖條件密切相連(Mallasenet al,2006)。Aksakal等(2011)發(fā)現(xiàn), 增加養(yǎng)殖密度會抑制抗氧化酶的代謝活力。羅非魚養(yǎng)殖密度較低時(<3尾/10L)時, 肝臟SOD與CAT活力的增加有助于降低魚體氧化應(yīng)激。同時, 本研究發(fā)現(xiàn)SOD與CAT活力隨著密度的繼續(xù)升高(>3尾/10L)而下降, 造成肝臟組織中的脂質(zhì)過氧化物的進一步增加, MDA含量也呈上升趨勢。這與彭士明等(2010)對銀鯧(Pampus argenteus)幼魚的研究結(jié)論相似, 適當?shù)酿B(yǎng)殖密度下可以刺激SOD與CAT活力的表達。

3.3 亞硝酸鹽與養(yǎng)殖密度的互作與二次效應(yīng)對吉富羅非魚幼魚生長及肝臟抗氧化指標的聯(lián)合影響

通過響應(yīng)曲面分析法可以更好地分析因子對響應(yīng)值的互作效應(yīng)。本實驗首次發(fā)現(xiàn)羅非魚的生長(表2)與SOD(表4)、CAT(表5)活力與考察因子亞硝酸鹽與養(yǎng)殖密度之間存在顯著的互作效應(yīng), 而對MDA含量無互作效應(yīng)。養(yǎng)殖密度對生長的影響隨著水體中亞硝酸鹽濃度的變化而變化。當水體中亞硝酸鹽濃度為0.02 mg/L, 特定生長率在密度為 1尾/10L時, 為6.90%/d; 而密度為5尾/10L時, 僅為2.76%/d。亞硝酸鹽濃度為2.8 mg/L, 密度為5尾/10L時, 特定生長率為2.60%/d?？赡苁且驗? 養(yǎng)殖密度較低時, 亞硝酸鹽對生長的影響被充足的水中溶氧所減弱(Fosset al,2007)。隨著養(yǎng)殖密度的增加, 高濃度的亞硝酸鹽環(huán)境影響了羅非魚呼吸頻率與代謝率, 魚體消耗更多能量用于緩解脅迫。水體中亞硝酸鹽的毒性也會破壞魚體血液中血紅蛋白的載氧能力, 造成機體供氧不足,降低羅非魚的代謝速率, 機體產(chǎn)生的能量又主要用于應(yīng)對生理脅迫, 從而引起生長減慢、抗氧化能力減弱。此外, 亞硝酸鹽效應(yīng)對生長的影響較養(yǎng)殖密度明顯; 而密度對肝臟MDA含量與SOD活力上較亞硝酸鹽明顯。

同時, 本研究首次發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度的二次效應(yīng)對生長、SOD與CAT活力有顯著影響, 亞硝酸鹽的二次效應(yīng)對SOD與CAT活力也有顯著影響。這在實際生產(chǎn)中有較高的應(yīng)用價值。說明適當?shù)酿B(yǎng)殖密度與亞硝酸鹽的刺激對生長與抗氧化酶活力并無抑制作用,甚至有所提高。提高的抗氧化酶活力有助于羅非魚增強其自身的非特異性免疫力, 提高抗應(yīng)激能力。

本實驗建立了考察因子與響應(yīng)值的二次回歸數(shù)學模型, 模型決定系數(shù)分別為0.9384、0.9004、0.9520和0.9650, 可用于分析與預(yù)測。然而, 需要注意的是,在實際集約化養(yǎng)殖中, 如果養(yǎng)殖過大, 對水質(zhì)管理不規(guī)范, 會引起水環(huán)境亞硝酸鹽濃度升高, 對魚體產(chǎn)生生理脅迫。通過及時加注新水, 增加溶氧, 可以降低亞硝酸鹽毒性, 減少魚體發(fā)病的幾率, 促進羅非魚產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)的發(fā)展。

馬愛軍, 陳 超, 雷霽霖等, 2005. 飼育密度對大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)生長、飼料轉(zhuǎn)化率及色素的影響. 海洋與湖沼, 36(3): 207—212

王文博, 李愛華, 汪建國等, 2004. 擁擠脅迫對草魚非特異性免疫功能的影響. 水產(chǎn)科學, 28(2): 139—144

曲克明, 徐 勇, 馬紹賽等, 2007. 不同溶解氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對大菱鲆的急性毒性效應(yīng). 海洋水產(chǎn)研究,28(4): 83—88

彭士明, 施兆鴻, 孫 鵬等, 2010. 養(yǎng)殖密度對銀鯧幼魚生長及組織生化指標的影響. 生態(tài)學雜志, 29(7): 1371—1376

董曉煜, 張秀梅, 張沛東, 2008. 溶解氧與養(yǎng)殖密度對褐牙鲆幼魚血細胞數(shù)量及血紅蛋白含量影響的研究. 海洋水產(chǎn)研究, 29(6): 40—46

強 俊, 楊 弘, 王 輝等, 2012. 急性溫度應(yīng)激對吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚生化指標和肝臟HSP70 mRNA表達的影響. 海洋與湖沼, 48(5): 943—953

強 俊, 徐 跑, 何 杰等, 2011. 氨氮與擁擠脅迫對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化指標的聯(lián)合影響.水產(chǎn)學報, 35(12): 140—144

Aksakal E, Ekinci D, Erdo?an Oet al, 2011. Increasing stocking density causes inhibition of metabolic–antioxidant enzymes and elevates mRNA levels of heat shock protein 70 in rainbow trout. Livestock Science, 141(1): 69—75

Atwood H L, Fontenot Q C, Tomasso J Ret al, 2001. Toxicity of nitrite to niletilapia: effect of fish size and environmental chloride. North American Journal of Aquaculture, 63:49—51

Camargo J A, Alonso A, Salamanca A, 2005. Nitrate toxicity to aquatic animals: a review with new data for freshwater invertebrates. Chemosphere, 58(9): 1255—1267

Chen J C, Cheng S Y, 2000. Recovery ofPenaeus monodonfrom functional anaemia after exposure to sublethal concentration of nitrite at different pH levels. Aquatic Toxicology,50(1—2): 73—83

Da Costa O T F, Ferreira D J D S, Mendon?a F L Pet al, 2004.Susceptibility of the Amazonian fish,Colossoma macropomum(Serrasalminae), to short-term exposure to nitrite.Aquaculture, 232(1—4): 627—636

Deane E E, Woo N Y S, 2007. Impact of nitrite exposure on endocrine, osmoregulatory and cytoprotective functions in the marine teleostSparus sarba. Aquatic Toxicology, 82(1):85—93

De Lima R L, Braun N, Kochhann Det al, 2011. Survival,growth and metabolic parameters of silver catfish,Rhamdia quelen, juveniles exposed to different waterborne nitrite levels. Neotropical Ichthyology, 9(1): 147—152

Frances J, Allan G L, Nowak B F, 1998. The effects of nitrite on the short-term growth of silver perch (Bidyanus bidyanus).Aquaculture, 163(1—2): 63—72

Foss A, Imsland A K, Roth Bet al, 2007. Interactive effects of oxygen saturation and ammonia on growth and blood physiology in juvenile turbot. Aquaculture, 271(1—4):244—251

Holt G J, Arnold C R, 1983. Effects of ammonia and nitrite on growth and survival of red drum eggs and larvae. Transactions of the American Fisheries Society, 112: 314—318

Jensen F B, 2003. Nitrite disrupts multiple physiological functions in aquatic animals. Comparative Biochemistry and Physiology A: Molecular & Integrative Physiology, 135(1):9—24

Kamstra A, Span J A, van Weerd J H, 1996. The acute toxicity and sub-lethal effects of nitrite on growth and feed utilization of European eel,Anguilla anguilla(L.).Aquaculture Research, 27(12): 903—911

Kebus M J, Collins M T, Brownfield M Set al, 1992. Effects of rearing density on the stress response and growth of rainbow trout. Journal of Aquatic Animal Health, 4(1): 1—6

Kroupova H, Machova J, Piackova Vet al, 2008. Effects of subchronic nitrite exposure on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Ecotoxicology and Environmental Safety, 71(3):813—820

Kroupová H, Máchová J, Piacková Vet al, 2006. Nitrite intoxication of common carp (Cyprinus carpioL.) at different water temperatures. Acta Veterinaria Brno, 75(4):561—569

Lin Y C, Chen J C, 2003. Acute toxicity of nitrite onLitopenaeus vannamei(Boone) juveniles at different salinity levels.Aquaculture, 224(1—4): 193—201

Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A Let al, 1951. Protein measurement with the Frolin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193(1): 265—275

Mallasen M, Valenti W C, 2006. Effect of nitrite on larval development of giant river prawnMacrobrachium rosenbergii. Aquaculture, 261(4): 1292—1298

Martínez-álvarez R M, Hidalgo M C, Domezain Aet al, 2002.Physiological changes of sturgeonAcipenser naccariicaused by increasing environmental salinity. The Journal of Experimental Biology, 205(23): 3699—3706

Merino G E, Piedrahita R H, Conklin D E, 2007. The effect of fish stocking density on the growth of California halibut(Paralichthys californicus) juveniles. Aquaculture, 265(1—4): 176—186

Montero D, Izquierdo M S, Tort Let al, 1999. High stocking density produces crowding stress altering some physiological and biochemical parameters in gilthead seabream,Sparus aurata, juveniles. Fish Physiology and Biochemistry, 20(1): 53—60

Nga B T, Lürling M, Peeters E T H Met al, 2005. Chemical and physical effects of crowding on growth and survival ofPenaeus monodonFavricius post-larvae. Aquaculture,246(1—4): 455—465

ōyanagui Y, 1984. Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity.Analytical Biochemistry, 142(2): 290—296

Park I S, Lee J, Hur J Wet al, 2007. Acute toxicity and sublethal effects of nitrite on selected hematological parameters and tissues in dark-banded rockfish,Sebastes inermis. Journal of the World Aquaculture Society, 38(2): 188—199

Perrone S J, Meade T L, 1977. Protective effect of chloride on nitrite toxicity to coho salmon (Oncorhynchus kisutch).Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 34(4):486—492

Qiang J, Yang H, Wang Het al, 2013.Physiological responses and HSP70 mRNA expression in GIFT tilapia juveniles,Oreochromis niloticusunder short-term crowding. Aquaculture Research, 46(2): 335—345, doi: 10.1111/are.12189

Russo R C, Thurston R V, 1977. The acute toxicity of nitrite to fishes. In: Tubb R A ed. Recent Advances in Fish Toxicology. Corvallis: U. S. Environmental Protection Agency, 118—131

Salama A J, 2005. Effect of high salinity water on growth and survival of Penaeid postlarvae from the red sea at different stocking densities. Journal of King Abdulaziz University-Science, 17(1): 3—9

Sinha A K, 1972. Colorimetric assay of catalase. Analytical Biochemistry, 47(2): 389—394

Siikavuopio S I, S?ther B S, 2006. Effects of chronic nitrite exposure on growth in juvenile Atlantic cod,Gadus morhua.Aquaculture, 255(1—4): 351—356

Svobodová Z, Máchová J, Poleszczuk Get al, 2005. Nitrite poisoning of fish in aquaculture facilities with water-recirculating systems. Acta Veterinaria Brno, 74(1):129—137

Wang W N, Wang A L, Zhang Y Jet al, 2004. Effects of nitrite on lethal and immune response ofMacrobrachium nipponense. Aquaculture, 232(1—4): 679—686

Wang Y B, Zhang W J, Li W Fet al, 2006. Acute toxicity of nitrite on tilapia (Oreochromis niloticus) at different external chloride concentrations. Fish Physiology and Biochemistry, 32(1): 49—54

Xiang R, Wang D N, 1990. The improvement of the method spectrophotometer on lipid peroxides thiobarbituric acid.Progress in Biochemistry and Biophysics, 7: 241—242

Yildiz H Y, K?ksal G, Borazan Get al, 2006. Nitrite-induced methemoglobinemia in Nile tilapia,Oreochromis niloticus.Journal of Applied Ichthyology, 22(5): 427—426