邢 婧 王 洋 宋曉青 唐小千 繩秀珍 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產(chǎn)動物病害與免疫學研究室 青島 266003)

隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 構建健康、無公害的養(yǎng)殖體系已經(jīng)成為一種趨勢, 接種疫苗是防治魚類細菌、病毒性疾病的有效方法(Ellis, 1988)。浸泡免疫方式接種疫苗具有省時省力、節(jié)約成本且對魚體刺激小等優(yōu)點, 是疫苗接種最便捷的途徑。為研究免疫后魚體免疫系統(tǒng)的變化以及疫苗的接種效果, 常檢測一些非特異性指標及特異性指標, 如魚類血清及黏液抗體水平變化(劉雨果等, 2011)、免疫相關酶活性(Danet al, 2013)、淋巴細胞數(shù)量(Tanget al, 2010)、呼吸爆發(fā)(Danet al, 2013)、補體活性(Danet al, 2013)等。近年來, 從基因水平對疫苗免疫效果進行研究的報道越來越多, 有研究發(fā)現(xiàn), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)浸泡免疫斜帶石斑魚(Epinephelus coioide)后,MHCⅡ類分子在鰓、皮膚、頭腎、脾臟和后腸中表達量均有不同程度的上調(diào)(王慶等, 2010); 浸泡免疫鰻弧菌(Vibrio anguillarum)滅活疫苗后, 大菱鲆(Scophthalmus maximus)多聚免疫球蛋白受體(plgR)基因在皮膚、鰓、脾臟中有較高水平的上調(diào)表達(丁冰潔等, 2013)。虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)浸泡免疫魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)后血清淀粉樣蛋白A(SSA)、白介素(IL)8、腫瘤壞死因子(INF)α、Toll-like受體(TLR)5、T細胞表面標志(TCR)β、IgT基因在脾臟中的表達量出現(xiàn)不同程度的上調(diào), 其中 SSA基因的上調(diào)最為顯著(Evenhuiset al, 2012); 浸泡免疫殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)后, 虹鱒魚鰓和腎中 IL-1β、IL-8、CD4、IgM 和 IgD基因的表達量均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢, IL-1β基因在腎臟中的表達量最高可達對照組的10倍(Cobo Labarcaet al, 2015)。這些研究結果均表明疫苗免疫能引起魚類諸多免疫相關基因的快速變化。但浸泡免疫后多組織多基因表達變化的研究還較少, 本文通過制備鰻弧菌全菌滅活疫苗, 將牙鲆經(jīng)浸泡免疫, 利用熒光定量PCR法研究免疫后牙鲆脾、頭腎、鰓3種組織中TLR2、TLR5M、髓樣分化因子MyD88、核轉錄因子(NF)- κB、IL-6、IFNγ、趨化因子 CXC、補體 C3、HSP70、CD4、自然殺傷細胞增強因子(NKEF)十一種免疫相關基因表達的動態(tài)變化, 從基因水平探究浸泡免疫對牙鲆免疫應答的影響, 篩選浸泡免疫效果的評價指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

牙鲆購自山東日照某牙鲆養(yǎng)殖場, 體長為 10—13cm, 實驗前將健康牙鲆在水槽中暫養(yǎng)1周, 水溫為20—22°C, pH為7.4—7.8, 期間連續(xù)充氣, 每天換水一次, 投喂標準飼料一次。

1.2 鰻弧菌全菌滅活疫苗的制備

鰻弧菌由本實驗室保存, 將菌種接種于2216 E固體培養(yǎng)基中, 28°C培養(yǎng)24h, 挑取單菌落至2216 E液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h, 之后6000g4°C離心15min,去上清液, 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.4)清洗沉淀3次, 最后以含0.5%甲醛(V/V)的PBS重懸, 4°C放置48h, 平板培養(yǎng)檢測無活菌存在, 再以PBS離心洗滌3次, 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 牙鲆的免疫及取樣

將暫養(yǎng)后的牙鲆隨機分為 2組, 每組 60尾。第一組浸泡于濃度為 1×108CFU/mL滅活疫苗菌液中,連續(xù)充氣浸泡30min; 第二組海水充氣浸泡30min作為對照。處理后于 0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、7d、14d分別在各組隨機取3尾牙鲆, 分別取脾、頭腎、鰓3種組織, 同一時間點來源于3尾牙鲆同一組織的樣品混勻后用于檢測比較11種免疫相關基因表達的變化及差異。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

取各組織樣品約 20mg, 應用 Trizol法提取總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 以微量核酸測定儀(NanoDrop 8000, Thermo, 美國)測定RNA的濃度和純度。提取的RNA利用反轉錄試劑盒(Applied Biosystems)經(jīng) RT-PCR 合成 cDNA。所得cDNA樣品–20°C保存, 備用。

1.5 熒光定量PCR所用引物的設計與驗證

根據(jù)已知的牙鲆核糖體RNA(18S RNA)、TLR2、TLR5M、MyD88、NF-κB、IL-6、IFNγ、CXC、C3、HSP70、CD4、NKEF基因序列, 采用Primer Premier 5.0軟件設計各基因特異性引物, 隨機選取對照組的脾、頭腎、鰓的cDNA樣品, 進行PCR擴增, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 選擇產(chǎn)物為單一條帶的引物, 利用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒(Takara, 美國)在熒光定量 PCR 儀(Light Cycler?480 PCR, Roche,Ⅱ

德國)上

進行擴增, 最終以擴增反應產(chǎn)生的溶解曲線是單一波峰的引物作為熒光定量PCR的特異性引物。

1.6 熒光定量PCR檢測

采用微量核酸測定儀測定所有取樣組織 cDNA樣品的濃度, 用 DEPC水(焦碳酸二乙酯滅菌水)調(diào)整所有組織cDNA濃度統(tǒng)一為0.05μg/μL, 以18S RNA為內(nèi)參, 利用SYBR?Premix Ex Taq試劑盒在Light Cycler?480ⅡPCR儀上進行擴增, 擴增體系為 20μL,即: 模板 cDNA 2μL, 正反向引物各 0.4μL(引物濃度為 10μmol/L), 反應混合液 10μL, 無菌水 7.2μL。為減小系統(tǒng)誤差每個樣品設置3個重復實驗, 擴增的條件為: 95°C 30s, 1 個循環(huán); 95°C 10s, 60°C 30s, 45 個循環(huán);95°C 5s, 60°C 1min, 95°C 5s, 1 個循環(huán); 40°C 冷卻。再次確認每個樣品擴增反應產(chǎn)生的溶解曲線是單一波峰, 并獲取Ct值(循環(huán)閾值), 用于數(shù)據(jù)處理及分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

熒光定量 PCR 所得數(shù)據(jù)按照 2?ΔΔCt法(紀冬等,2009)進行處理, 所有數(shù)值均用平均值±標準差(±SD)表示。利用Origin 8.0軟件作圖, SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析, 采用 T-檢驗分析不同時間點基因表達量的差異, 以P<0.05作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR所用引物的獲得

經(jīng)過常規(guī)PCR-瓊脂糖凝膠電泳及熒光定量PCR溶解曲線驗證, 最終獲得11種基因以及18S RNA內(nèi)參的特異性引物, 各基因引物名及引物序列、退火溫度等信息見表1。應用特異性引物進行熒光定量PCR,所有檢測樣品的擴增結果均為單一產(chǎn)物。

表1 熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

2.2 TLR2在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, TLR2基因的表達量自12h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的12.15倍, 而后逐漸下降, 至14d時降至與對照組無顯著差異(圖1a);頭腎中, TLR2基因的表達量自4h起顯著高于對照組,48h達到最高值, 是對照組的 5.40倍, 而后逐漸下降,至14d與對照組無顯著差異(圖1b); 鰓中, TLR2自4h起顯著高于對照組, 之后快速上升, 24h達到最高值,是對照組的3.66倍, 之后逐漸下降, 至14d時與對照組無顯著差異(圖1c)。

2.3 TLR5M在脾臟、頭腎和鰓中的表達

圖1 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中TLR2相對表達量Fig.1 Expression of TLR2 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

在脾臟中, TLR5M基因的表達量雖然略有變化,但相對于對照組變化不顯著(圖2a); 頭腎中, TLR5M基因的表達相對于對照組也無顯著變化(圖 2b); 鰓中,

TLR5M基因的表達呈現(xiàn)顯著上調(diào), 表達量自8h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的2.75倍, 而后逐漸下降, 至 7d時降至與對照組無顯著差異(圖 2c)。

圖2 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中TLR5M相對表達量Fig.2 Expression of TLR5M in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.4 MyD88在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, MyD88基因的表達量自12h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的 4.82倍, 而后逐漸下降, 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖3a);頭腎中, MyD88基因的表達量自24h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的 3.04倍, 之后維持在較高水平, 96h后逐漸下降, 至14d時降至與對照組無顯著差異(圖3b); 鰓中, MyD88基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 略有下降后再次上升, 48h達到最高值, 是對照組的 2.58倍, 之后逐漸下降, 至 14d時與對照組無顯著差異(圖3c)。

2.5 NF-κB在脾臟、頭腎和鰓中的表達

圖3 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中MyD88相對表達量Fig.3 Expression of MyD88 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖4 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中NF-κB相對表達量Fig.4 Expression of NF-κB in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

脾臟中, NF-κB基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的10.43倍, 而后逐漸下降, 至 14d時降至與對照組無顯著差異(圖 4a);頭腎中, NF-κB基因的表達量自4h起顯著高于對照組,24h達到最高值, 是對照組的8.33倍, 而后逐漸下降,至 7d時降至與對照組無顯著差異(圖 4b); 鰓中,NF-κB基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的 2.04倍, 之后逐漸下降, 至72h時與對照組無顯著差異(圖4c)。

2.6 CD4在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, CD4表達量自免疫后12h開始出現(xiàn)顯著高于對照組, 至 96h達到峰值, 為對照組的 6.62倍,之后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖5a); 頭腎中, CD4基因的表達量自 8h起顯著高于對照組, 72h達到最高值,是對照組的 6.25倍, 而后逐漸下降(圖 5b); 鰓中,CD4基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 72h達到最高值, 是對照組的 2.15倍, 之后逐漸下降, 至 14d時降至與對照組無顯著差異(圖5c)。

2.7 IL-6在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, IL-6基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的10.65倍, 而后逐漸下降, 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖6a); 頭腎中, IL-6基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的7.93倍, 而后逐漸下降, 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖6b); 鰓中, IL-6基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值,是對照組的10.42倍, 之后逐漸下降, 至7d時與對照組無顯著差異(圖6c)。

圖5 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中CD4相對表達量Fig.5 Expression of CD4 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖6 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中IL-6相對表達量Fig. 6 Expression of IL-6 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.8 IFNγ在脾臟、頭腎和鰓中的表達

IFNγ基因在脾臟和頭腎 2種組織中的表達均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。脾臟中, IFNγ基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的 2.76倍, 而后逐漸下降, 48h出現(xiàn)小幅度上調(diào), 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖7a); 頭腎中, IFNγ基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的 3.77倍, 而后逐漸下降, 96h時與對照組無顯著差異, 而后出現(xiàn)短暫的上升, 至14d時降至與對照組無顯著差異(圖7b); 鰓中, IFNγ基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 之后快速上升, 24h達到最高值, 是對照組的 2.30倍, 之后逐漸下降, 至14d時與對照組無顯著差異(圖7c)。

2.9 CXC在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, CXC基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的 3.28倍, 而后逐漸下降, 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖8a); 頭腎中, CXC基因的表達量自 48h起顯著高于對照組,72h達到最高值, 是對照組的3.33倍, 而后逐漸下降,至 14d時降至與對照組無顯著差異(圖 8b); 鰓中,CXC基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 是對照組的 3.19倍, 之后逐漸下降, 至 14d時與對照組無顯著差異(圖8c)。

圖7 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中IFNγ相對表達量Fig.7 Expression of IFNγ in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖8 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中CXC相對表達量Fig.8 Expression of CXC in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.10 C3在脾臟、頭腎和鰓中的表達

免疫后C3在脾臟、頭腎和鰓組織中的表達量均有上調(diào), 但上調(diào)幅度都較低, 峰值是對照組的3倍左右。脾臟中, 自8h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 為對照組的2.52倍, 而后有所下降, 7—14d時又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達(圖9a); 頭腎中, C3的表達量自4h起顯著高于對照組, 48h達到最高值, 為對照組的3.71倍, 而后逐漸下降, 至14d與對照組無顯著差異(圖9b); 鰓中, C3的表達量自8h起顯著高于對照組,48h達到最高值, 為對照組的2.73倍, 之后逐漸下降,至7d與對照組無顯著差異(圖9c)。

圖9 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中C3相對表達量Fig.9 Expression of C3 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.11 HSP70在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, HSP70基因的表達量自 4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的 7.69倍, 而后逐漸下降, 至7d時降至與對照組無顯著差異(圖10a);頭腎中, HSP70基因的表達量自 8h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的 4.67倍, 而后逐漸下降, 至14d時降至與對照組無顯著差異(圖10b); 鰓中, HSP70基因的表達量自 4h起顯著高于對照組,24h達到最高值, 是對照組的9.65倍, 之后逐漸下降,至7d時降至與對照組無顯著差異(圖10c)。

圖10 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中HSP70相對表達量Fig.10 Expression of HSP70 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.12 NKEF在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中, NKEF基因的表達量自8h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的3.11倍, 而后逐漸下降, 至 7d時恢復對照組水平(圖 11a); 頭腎中, NKEF基因的表達量自 4h起顯著低于對照組,48h達到最低值, 是對照組的 0.49倍, 而后逐漸上調(diào)(圖 11b); 鰓中, NKEF基因的表達量自4h起顯著高于對照組, 24h達到最高值, 是對照組的 4.39倍, 之后逐漸下降, 至 14d時與對照組無顯著差異(圖 11c)。

圖11 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中NKEF相對表達量Fig.11 Expression of NKEF in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對照組之間有顯著差異(P<0.05)

3 討論

3.1 11種基因表達量變化的總體趨勢

本實驗結果顯示, 浸泡免疫方式能引起牙鲆 11種免疫相關基因在三種組織中的顯著上調(diào)或下調(diào)表達。TLR2、TLR5M、NF-κB和MyD88是TLR信號通路的關鍵分子, TLR2可識別合成的三酰脂肽Pam3CSK4和革蘭氏陽性細菌的脂肽(Weiet al, 2011);在哺乳動物中, 膜結合的TLR5可以識別細菌的鞭毛蛋白成分, TLR5M基因依賴MyD88途徑激活鞭毛介導的 NF-κB, 之后誘導前炎性細胞因子(白細胞介素和腫瘤壞死因子等)和I型干擾素的產(chǎn)生(Hwanget al,2010), 由 I型干擾素介導直接的防御反應, 而 MyD88是除TLR3以外所有TLRs的信號轉導因子(Tanget al,2012)。CD4是T細胞重要的表面分子, CD4+T細胞具有輔助性T細胞的功能, 是MHCⅡ類分子的受體,在機體特異性免疫識別外源性抗原中具有重要意義(Katoet al, 2013)。IL-6是由輔助性T細胞分泌的一種多效的細胞因子, 有效促進B細胞的增殖分化和T細胞的成熟, 在非特異性及特異性免疫應答中都能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用, 在炎癥反應的早期即可大量表達(Nakaet al, 2002)。IFNγ屬于Ⅱ型干擾素, 除具有抗病毒、抗增殖活性外, 其主要生物學活性為免疫調(diào)節(jié)作用(Yanget al, 2013)。HSP70可作為分子伴侶,參與蛋白質(zhì)代謝, 協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、組裝及轉運, 并能降解錯誤裝配的蛋白質(zhì)等, 它的表達受外界環(huán)境及機體自身變化的調(diào)控, 能夠在外源病原體刺激機體時發(fā)揮應激作用(Cuiet al, 2011)。CXC能夠募集免疫細胞遷移, 在炎性反應及病原侵染中發(fā)揮重要作用。C3是存在于血清中的具有非特異性抵抗作用的體液分子, 是補體活化途徑的重要因子, 發(fā)揮直接的抗微生物作用和調(diào)理作用, 在魚類免疫防御機制中發(fā)揮著重要作用(陳勇等, 2008)。NKEF最初在人類紅細胞中克隆得到, 是一種可溶性因子, 屬于一個保守的Prx基因家族, 從原核生物到高等哺乳動物中均有發(fā)現(xiàn), 它可以增強自然殺傷細胞的細胞毒性活動, 從而促進機體非特異性免疫的發(fā)生(孫晶等, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn), 所研究的11種基因中, TLR2、MyD88、NF-κB、IL-6、IFNγ、CXC、C3 、HSP-70 和 CD4九種基因呈現(xiàn)了上調(diào)表達趨勢, 表達量峰值出現(xiàn)在免疫后24—96h, 為對照組的 2—12倍。說明這些基因通過快速大量的表達參與牙鲆的免疫應答。

3.2 C3、TLR5M、NKEF三種基因的表達變化

有研究發(fā)現(xiàn), 南亞野鯪(Labeo rohita)經(jīng)遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)免疫后, C3基因在腎組織中的表達量呈顯著上調(diào)的趨勢(Mohantyet al, 2010),本實驗上調(diào)表達的基因中, C3的表達存在其獨特性,C3在 3種組織中的表達上調(diào)呈現(xiàn)出雙波峰現(xiàn)象, 第一次峰值出現(xiàn)在免疫后48h, 在14d時出現(xiàn)第二次峰值, 但低于48h時。結合補體的活化機制推斷, 第一個峰值的出現(xiàn)可能與浸泡免疫后疫苗直接刺激機體使C3基因大量表達以發(fā)揮其直接的抗微生物作用有關; 基因的第二次上調(diào)表達可能與補體系統(tǒng)的激活有關, 機體受到抗原刺激后啟動特異性免疫應答, 漿細胞分泌IgM到血液、黏液中, 形成抗原抗體復合物,進而激活補體活化途徑。

本研究中, 免疫后TLR5M基因表達量在脾臟和頭腎中與對照組無顯著差異, 在鰓中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,為對照組的2.75倍。結合之前的相關報道, 鰻弧菌及其鞭毛刺激虹鱒細胞系后 TLR5M 表達變化不顯著,而TLR5S顯著上調(diào)(Tsujitaet al, 2004)。推斷TLR5M在消化道的細菌識別中發(fā)揮重要作用而在其他器官作用不顯著, 且TLR5M與TLR5S識別鞭毛的成分有可能不同, 導致其表達出現(xiàn)差異。鰓中TLR5M基因的上調(diào)表達可能與浸泡免疫時病原直接接觸到鰓組織, 短時間內(nèi)引起了TLR5M的應激表達有關。

研究發(fā)現(xiàn), 鯉魚(Cyprinus carpioL.)注射感染鯉春病毒(Spring Viraemia of Carp Virus)后, 脾臟和鰓組織中的 NKEF-B基因的表達量相對于對照組顯著上調(diào), 而頭腎中 NKEF-B基因的表達量顯著下調(diào)(Huanget al, 2009)。實驗結果顯示, 牙鲆浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后, NKEF基因的表達量在脾臟和鰓組織中顯著上調(diào), 而在頭腎中顯著下調(diào), 表達量最小值為對照組的 0.49倍, 與之前的研究結果一致, 推測NKEF基因在機體非特異性免疫防御中可能起重要作用, 頭腎作為魚類主要的造血和淋巴器官, 它在受到外來抗原的刺激時會將產(chǎn)生的血細胞和淋巴細胞轉運到血液及其它組織中, 這也許是造成NKEF基因在頭腎中下調(diào)表達的原因, 但詳細的作用機制還有待進一步研究。

3.3 11種基因表達變化的組織差異性

實驗結果顯示, 在脾臟和頭腎中, TLR2、NF-κB、和 CD4基因的表達峰值高于鰓; 在脾臟和鰓中,IL-6、HSP70和 NKEF基因的表達峰值均高于脾臟;TLR5M、MyD88、IFNγ、CXC和C3基因在三個組織中的表達峰值差異不大; 在三個組織中每個基因表達峰值出現(xiàn)的時間基本一致。結合之前的研究結果, 注射免疫后脾臟和頭腎中免疫相關基因的表達量均顯著高于鰓, 且表達量峰值出現(xiàn)的時間早于鰓(宋曉青等, 2014), 推測浸泡免疫可以迅速啟動魚類的黏膜免疫, 使鰓組織中免疫相關基因表達量上調(diào)。因此, 在評價疫苗浸泡免疫效果時, 除檢測脾臟和頭腎等主要的免疫器官外, 鰓也是需要檢測的組織。

本文通過比較免疫后11種基因在三種組織中的表達量變化趨勢, 發(fā)現(xiàn)IL-6和HSP70基因在三種組織中的表達量上調(diào)峰值較高, 為對照組的 5—11倍,且變化較為迅速, 4h即出現(xiàn)顯著上調(diào), 在24h達到峰值。有研究也發(fā)現(xiàn), 鰻弧菌感染金頭鯛(Sparus aurata)后, IL-6基因在4h內(nèi)即呈現(xiàn)上調(diào)表達(Castellanaet al,2008); 海豚鏈球菌(GIFTStrepstococcus iniae)免疫吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)后, HSP70基因表達量在48h之內(nèi)上調(diào)至對照組的5倍多(王瑞等, 2010)。由此可見, IL-6和HSP70基因在浸泡免疫滅活疫苗后是較為敏感的因子, 可以作為疫苗浸泡免疫后的效果評價指標。

4 結論

浸泡免疫后, 鰻弧菌滅活疫苗有效引起了牙鲆的特異性和非特異性免疫應答反應, 各免疫相關基因在脾臟、頭腎和鰓三種組織中出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達, 其中IL-6和HSP70基因在三個組織中均表達變化迅速, 表達豐度較高, 可以作為浸泡免疫后免疫效果的評價指標。在監(jiān)測浸泡免疫效果時,除脾臟和頭腎外, 鰓也是重要的檢測組織。

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