張 馳 姜華鵬 王叢叢, 許強(qiáng)華,,

(1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306; 2. 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306;3. 農(nóng)業(yè)部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測試驗(yàn)站 上海 201306; 4. 國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 上海 201306;5. 遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306)

南極位于地球最南端, 又稱“第七大陸”, 為全球氣候變化敏感區(qū)。南極水域低溫高氧, 生存著許多鮮為人知的極地水生生物。南極所具有的獨(dú)特地理及氣候特征, 造就了極地生物特殊的生理特征, 使其能夠適應(yīng)南極低溫高氧極地環(huán)境, 在生物進(jìn)化中極具研究價(jià)值。南極圈內(nèi)生活的南極魚已成為研究魚類適應(yīng)性進(jìn)化和耐寒機(jī)制的優(yōu)良模型。

作者在本文中以獨(dú)角雪冰魚(Chionodraco hamatus,CH)和伯氏肩孔南極魚(Trematomus bernacchii, TB)為主要研究對象。獨(dú)角雪冰魚屬于鱸形目(Perciformes)、南極魚亞目(Notothenioidei)、鱷冰魚科(Channichthyidae),生活在南極水深200—800 m的水域中, 體表無鱗片,體內(nèi)不含血紅蛋白, 可能通過鰓和極薄的皮膚吸收海水中的氧(Bargelloniet al, 1994; Eastmanet al,2004)。伯氏肩孔南極魚為鱸形目(Perciformes)、南極魚亞目(Notothenioidei)、南極魚科(Notothenioidei),生活在南極水深700m以上的水域中, 其生存環(huán)境與獨(dú)角雪冰魚相似且與獨(dú)角雪冰魚有較近的親緣關(guān)系,但體內(nèi)表達(dá)有正常的血紅蛋白。本文以探究獨(dú)角雪冰魚的進(jìn)化機(jī)制為大背景, 從對血紅蛋白生成有促進(jìn)作用關(guān)鍵因子之一 EPO入手, 來探究血紅蛋白丟失的潛在機(jī)制以及EPO在其中起的作用。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO) 是哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的主要調(diào)控因子, 主要由腎臟和胚胎肝臟分泌。研究表明EPO為氧依賴型基因, 缺氧可以誘導(dǎo) EPO基因的轉(zhuǎn)錄, 從而達(dá)到調(diào)控效果(葛全興等, 2009)。尤其是低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducing factor-1, HIF-1), 在缺氧條件下能夠進(jìn)入核內(nèi)形成異二聚體HIF-1復(fù)合物, 并結(jié)合在EPO的3￠端約120 bp的區(qū)域內(nèi)的順式調(diào)控元件上(桂長云等, 1999)。該順勢調(diào)控元件為(5￠-RCGTG-3￠)保守序列構(gòu)成, 是典型的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element, HRE)(桂長云等, 1999)。EPO作為一種糖蛋白激素, 能夠刺激骨髓造血功能, 及時(shí)有效地增加紅細(xì)胞的數(shù)量, 從而提高血液的攜氧能力, 增加血紅蛋白含量與紅細(xì)胞比積(血液中紅細(xì)胞百分比)(Katakuraet al, 2013)。高海拔哺乳動(dòng)物低氧促進(jìn)紅細(xì)胞生成是通過提高血漿EPO水平來實(shí)現(xiàn)的, 以改善缺氧引起的生理反應(yīng); 紅細(xì)胞增多又可反饋性抑制 EPO的生成, 以使紅細(xì)胞量精確地適應(yīng)機(jī)體的需要。在非哺乳動(dòng)物中, EPO的保守性以及刺激腎臟中紅色祖先細(xì)胞分裂和分化作用同哺乳動(dòng)物是一致的(Stachuraet al, 2009, 2011)。在非洲爪蟾體外實(shí)驗(yàn)中也同樣證明 EPO系統(tǒng)在正常狀態(tài)下刺激幼紅血細(xì)胞的增殖, 并使其在急性嚴(yán)重貧血情況中恢復(fù)過來(Nogawa-Kosakaet al, 2010)。這表明 EPO系統(tǒng)在紅系器官發(fā)育中具有關(guān)鍵作用。近年來, 體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道都暗示了 EPO的作用不僅僅局限于紅系細(xì)胞生成。在非造血系統(tǒng)中, EPO在低氧狀態(tài)下具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用(Kulkarniet al, 2010; Ostrowskiet al, 2011)。

值得一提的是, 魚類 EPO功能的研究尚處于起步階段。人們先后在河豚、斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了 EPO基因的結(jié)構(gòu)、HRE(低氧反應(yīng)元件)所在位點(diǎn), 對EPO在魚類缺氧應(yīng)答機(jī)制中所起的作用有了初步認(rèn)識(Chouet al, 2004; Chuet al, 2007; Paffett-Lugassyet al,2007)。對魚類EPO結(jié)構(gòu)和功能的研究仍將繼續(xù)。本研究首次獲得了獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚的EPO基因序列, 對其分子進(jìn)化水平進(jìn)行了初步探索, 以期在 EPO對魚類的功能研究方面做出貢獻(xiàn), 為極端環(huán)境下的生物長期適應(yīng)機(jī)制提供幫助。本研究為揭示EPO基因在南極冰魚內(nèi)的遺傳特性提供理論依據(jù),并為進(jìn)一步探討 EPO基因在極端低溫高氧環(huán)境中的魚類適應(yīng)性進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚樣本分別采集于南極埃默里冰架和南極熊貓碼頭。利用冰鑿打冰洞, 再進(jìn)行漁釣的方式, 獲得活體南極魚樣本數(shù)十條?；铙w迅速凍存于–80°C超低溫冰箱。由雪龍?zhí)枎Щ氐膬龃鏄颖居缅a箔紙包裹后液氮帶回上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院保護(hù)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室, –80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Taq DNA Polymerase (艾德萊);Agarose N、氯仿、異丙醇、5×TAE 緩沖液、瓊脂糖、氯化鈉、酵母提取物(上海生工); 6×loading buffer、0.1%DEPC 及 75%乙醇(天根); X-gal、IPTG (Amersco);DNA膠回收試劑盒(Axygen Biosciences); TRIzol?試劑 (Invitrogen Corp); 胰蛋白胨 (OXOID); pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞及DL5000 DNA標(biāo)記(TaKaRa);Trans 2K Plus DNA標(biāo)記(TransGen)。

1.2 方法

1.2.1 南極魚基因組 DNA(gDNA)提取及 PCR擴(kuò)增取獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的肌肉組織, 參照Trizol法(Invitrogen Corp, USA)分別提取其基因組DNA。用NanoDrop?2000 (Thermo)與1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中EPO相應(yīng)的同源序列(表 1)(Katakuraet al, 2013), 利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物, 引物由上海生工合成(表2)。

表1 EPO相應(yīng)的同源序列信息Tab.1 The information of the respective counterparts of EPO homologous sequences

表2 EPO基因PCR引物信息Tab.2 The information of PCR primers of EPO gene

PCR 總反應(yīng)體系為 25 μL, 含 0.5 μL 10 μmol/L正向和反向引物、2.5 μL 10×Buffer (含 MgCl2)、2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L)、0.5 μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)。反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 5 min; 94°C 變性30 s, 58—64°C退火30 s (退火溫度依引物而異),72°C延伸1—2 min (延伸溫度依擴(kuò)增片段長短而異),32個(gè)循環(huán); 72°C終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、轉(zhuǎn)化與測序 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段, 與 pMD19-T克隆載體于 16°C下連接過夜; 以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞, 藍(lán)白斑篩選陽性克隆。菌落PCR (以陽性菌落為模板)鑒定重組轉(zhuǎn)化菌(莎姆布魯克, 2002; 陳書霞等, 2006)。經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆的菌落重新挑入500 μL含Amp的LB培養(yǎng)基中37°C 210 r/min培養(yǎng)14 h后, 送上海生工進(jìn)行雙向測序, 測序引物為載體通用引物。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用Seqman、Editseq等軟件進(jìn)行測序序列片段拼接; 通過 NCBI blast two sequences完成mRNA序列與基因組DNA比對, 利用相關(guān)軟件處理結(jié)果, 并仔細(xì)核對序列信息; EPO基因開放閱讀框(ORF)利用NCBI的ORF Finder程序分析(羅軼, 2008); 使用 Smart在線分析網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)以及 NCBI中的 CDD 庫(Conserved Domain Database)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的保守性分析(Marchler-Baueret al, 2005); 使用Scanprosite在線軟件(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/)分析其功能位點(diǎn)差異; 使用SignalP 4.1 server在線處理網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)分析蛋白潛在信號肽; 利用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列的理化特性(Wilkinset al, 1999); 利用Protscale網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)親疏水性; 使用 PredictProtein網(wǎng)站(http://www.predictprotein.org)和 Psipred分析網(wǎng)站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(李盛杰等, 2013); 根據(jù)PSD數(shù)據(jù)庫和SWISS -MODEL在線建模網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模, 構(gòu)建蛋白質(zhì)的3D模型(陶士珩, 2007;劉虎岐等, 2010); 利用PyMOL和Spdbv軟件修飾并輸出其 3D 結(jié)構(gòu)(李盛杰等, 2013)。最后使用DNAMAN、MEGA軟件進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹(季舒涵等, 2010; 張寶等, 2013)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極魚EPO基因結(jié)構(gòu)及序列比較

通過 PCR分段擴(kuò)增, 分別獲得了獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚DNA片段(圖1)。陽性克隆菌經(jīng)過測序后獲得測序結(jié)果, 利用Editseq和Seqman將測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接后, 獲得了該基因擴(kuò)增的核心區(qū)及側(cè)翼區(qū)部分序列。其中, 得到獨(dú)角雪冰魚基因全長2727 bp, 基因編碼區(qū)558 bp, 而伯氏肩孔南極魚基因全長2820 bp, 基因編碼區(qū)558 bp。為保證分析序列結(jié)果的可靠性, 拼裝EPO 序列與紅旗東方 鲀、羅非魚等同源性高的相關(guān)物種進(jìn)行序列特征性比對, 結(jié)果證明其拼接序列位于基因組EPO區(qū)域。

對 EPO基因的結(jié)構(gòu)分析表明, 獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的EPO皆由5個(gè)外顯子組成, 中間穿插有4個(gè)內(nèi)含子。其序列差異比對結(jié)果表明, 這兩個(gè)基因gDNA序列相似性為80.1%, 其主要的序列差異位于內(nèi)含子非編碼區(qū), 共有6個(gè)Gap, 平均Gap長度為19 bp, 最大一致序列長度為640 bp。獨(dú)角雪冰魚同紅鰭東方 鲀序列相似性僅48.9%, 表明EPO基因的種屬差異性(圖2)。

圖1 南極魚擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of Antarctic ice fish EPO amplified fragmentsM1: DL5000 DNA marker; M2: Trans 2K Plus DNA marker; 獨(dú)角雪冰魚EPO擴(kuò)增片段1, 2, 3, 4 (1, 3, 4, 5); 伯氏肩孔南極魚EPO擴(kuò)增片段1, 2, 3, 4 (2, 6, 7, 8)

圖2 南極魚基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Diagram of EPO genetic structures of Antarctic icefish黑色方框表示為外顯子區(qū)域, 直線表示為內(nèi)含子區(qū)域。紅旗東方 鲀EPO基因?yàn)橥庠磪⒖蓟?/p>

2.2 南極魚EPO基因 CDS區(qū)核苷酸序列及編碼氨基酸序列分析

為了探討EPO基因的功能域在獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚中的差異, 對克隆的基因序列進(jìn)行比對(圖3)。兩者之間的ORF序列之間同源性為95.2%,表明南極魚中的相對保守性。EPO蛋白前體為一種跨膜糖蛋白分子。根據(jù)SignalP 4.1 server、SMART軟件和NCBI檢測得到兩者的EPO都包含一個(gè)信號肽區(qū)和一個(gè)EPO_TPO保守結(jié)構(gòu)域(圖4)。獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚 EPO基因 ORF推導(dǎo)氨基酸序列之間存在16處位點(diǎn)差異, 其中EPO_TPO區(qū)域有15個(gè)氨基酸的差異。經(jīng)過Scanprosite的分析, 結(jié)果表明伯氏肩孔南極魚有兩個(gè)蘇氨酸(Thr)和一個(gè)絲氨酸(Ser)可以成為蛋白激酶 C磷酸化位點(diǎn), 有一個(gè)蘇氨酸和三個(gè)絲氨酸可以成為酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點(diǎn); 而相比較而言, 獨(dú)角雪冰魚分別增加了一個(gè)絲氨酸位點(diǎn)可以被蛋白酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化(圖 4)。

圖3 南極魚核苷酸序列間比對Fig.3 Alignment of nucleotide sequences of Antarctic ice fish EPO灰色部分表示物種間氨基酸核苷酸序列相同; 白色表示物種間核苷酸序列不同

2.3 南極魚EPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 EPO蛋白理化性質(zhì)分析 用ProtParam軟件預(yù)測南極魚 EPO的理化性質(zhì), 結(jié)果顯示獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚皆由185個(gè)氨基酸組成, 其分子式分別為 C904H1472N262O271S8和 C907H1469N257O267S9, 相應(yīng)分子量分別為20.60 kDa和20.53 kDa, 理論等電點(diǎn)(pI)分別為6.65和6.28, 蛋白呈酸性。獨(dú)角雪冰魚EPO氨基酸殘基中Leu (16.8%)、Ser (9.2%)及 Val (8.1%)的頻率較高, 疏水性氨基酸占 43.8%, 極性不帶電荷氨基酸占 32.4%, 極性帶電荷氨基酸占 23.8%, 其中包括 10.3%的酸性氨基酸(D, E)及 13.5%的堿性氨基酸(H, R, K); 伯氏肩孔南極魚中 Leu (18.4%)、Ser(8.1%)、Ala (7.0%)的頻率較高, 疏水性氨基酸占45.4%, 極性不帶電荷氨基酸占 30.8%, 極性帶電荷氨基酸占 23.8%, 其中包括 10.3%的酸性氨基酸及13.5%的堿性氨基酸(表3)。獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚 EPO 蛋白消光系數(shù)(M–1cm–1γ=280nm)同樣為23740, 其不穩(wěn)定系數(shù)分別為36.00和36.87(通常當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)小于 40時(shí), 可將蛋白質(zhì)確定為穩(wěn)定類蛋白質(zhì)), 皆屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì)(Guruprasadet al, 1990),且預(yù)計(jì)在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h。獨(dú)角雪冰魚疏水指數(shù)為106.43, 伯氏肩孔南極魚疏水指數(shù)為110.6, 平均親水性分別為 –0.071和0.022, 都屬可溶性蛋白范圍(Kyteet al, 1982)。

圖4 EPO氨基酸序列多重比對及保守結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)分析Fig. 4 Alignment of amino acid sequences and conservative domain structure and functional sites of Antarctic icefish EPO

表3 南極魚EPO的氨基酸組成Tab.3 The composition of amino acids in EPO

2.3.2 南極魚 EPO二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用PredictProtein和 PSIPRED軟件預(yù)測南極魚的二級結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明: 獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚EPO_TPO域都主要由 4個(gè)反相平行的 α螺旋和兩長兩短的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Loops)區(qū)域構(gòu)成, 為 EPO蛋白的典型結(jié)構(gòu)(Boisselet al, 1993), 僅伯氏肩孔南極魚預(yù)測出置信度較低的兩個(gè)小的β折疊區(qū)域(圖5)。利用 SWISS-MODEL同源建模網(wǎng)站和 PyMol軟件對南極冰魚 EPO建模獲得三級結(jié)構(gòu)模型, 該結(jié)果表明獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚都呈4個(gè)反向平行的α螺旋結(jié)構(gòu), 由α螺旋與無規(guī)卷曲構(gòu)成。即使同源構(gòu)建模型所用模板不同, 其主要的4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)也是保守的, 這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖 6)。

圖5 南極魚EPO的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predictions of the secondary structure of the Antarctic icefish EPOa. 獨(dú)角雪冰魚二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果; b. 伯氏肩孔南極魚二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖6 南極魚EPO的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predictions of the tertiary structure of the Antarctic icefish EPOa. 獨(dú)角雪冰魚EPO同源建模結(jié)果(以PDB數(shù)據(jù)庫中1eer.1.A為模板); b. 伯氏肩孔南極魚EPO同源建模結(jié)果(以PDB數(shù)據(jù)庫中1cn4.1.C為模板)

2.4 南極魚EPO同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

將獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚 EPO基因的氨基酸序列與其它物種的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析(圖7)。其中, 獨(dú)角雪冰魚EPO與其它魚類的同源性在 70%—90%之間, 與兩棲類的同源性約 85.5%, 與哺乳動(dòng)物同源性在 53.9%—85.5%之間。數(shù)據(jù)表明,EPO種內(nèi)差異較小, 同源性總體較高, 進(jìn)化比較保守;但EPO基因的種間差異比較明顯。用MEGA5軟件分析南極冰魚及其它魚類、兩棲類、哺乳類 EPO基因編碼區(qū)氨基酸系統(tǒng)發(fā)生樹, 其中獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚與其它魚類的遺傳關(guān)系很近, 與兩棲類、哺乳類的遺傳距離較遠(yuǎn)(圖8)。

圖7 各物種EPO基因推定的氨基酸序列間的遺傳距離比較Fig.7 The sequence identity of inferred EPO amino acid sequences

圖8 利用MEGA軟件中N-J法構(gòu)建的EPO系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 The Neighbor-Joining tree of EPO constructed with MEGA5 software

3 討論

南極作為地球上特殊的極端環(huán)境之一, 其特殊物種南極冰魚在長期進(jìn)化選擇過程中所占據(jù)的重要位置值得去做深入研究。EPO是與低氧適應(yīng)、組織保護(hù)和血系生成相關(guān)的重要基因, 但目前還未獲得其在極端環(huán)境下尤其是低溫下的表達(dá)調(diào)控的機(jī)制和功能。尤其是南極冰魚的特殊存在以及其基因組研究價(jià)值, 為人們提供了一個(gè)優(yōu)秀的耐寒基因庫(許強(qiáng)華等,2014)。南極魚類通過三千萬年的快速進(jìn)化中, 在南大洋逐漸變冷直至冰凍的期間演化成了南大洋最多樣化的魚種。作者希望通過比較基因組學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及生物統(tǒng)計(jì)學(xué)等相關(guān)專業(yè)知識, 對 EPO基因獲得更深層的認(rèn)識, 推測它在生物適應(yīng)性進(jìn)化過程中所起的作用。尤其是在全球變暖的生態(tài)大背景下,南極冰魚如何適應(yīng)正在慢慢變化的南極低溫環(huán)境。目前, 針對南極水生動(dòng)物 EPO的研究成果在國內(nèi)外鮮有發(fā)布, 而對于南極特有的水生動(dòng)物之一南極冰魚的研究更是少之甚少。

對獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚 EPO基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 長度分別為2727 bp和2820 bp。南極魚EPO基因結(jié)構(gòu)在魚類中具有一致性, 都包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子, 種屬內(nèi)部同源性較高, 差異性主要體現(xiàn)在非編碼區(qū)。而針對編碼區(qū)的研究發(fā)現(xiàn), 南極魚EPO推導(dǎo)氨基酸數(shù)目與其它魚類基本一致, 但與兩棲類、哺乳動(dòng)物類差異性較大。獨(dú)角雪冰魚與伯氏肩孔南極魚相比, 盡管存在有 26個(gè)堿基差異, 其中 10個(gè)堿基突變均屬同義突變, 所編碼的氨基酸序列同源性為91.35%。說明獨(dú)角雪冰魚EPO與伯氏肩孔南極魚EPO一致, 兩者之間有生物學(xué)功能上的一致性?；诎被嵝蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中, 獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚EPO聚類, 親緣關(guān)系極近, 與魚類的親緣關(guān)系也在91.35%—70%之間, 符合進(jìn)化規(guī)律。這說明 EPO在生物長期進(jìn)化過程中保持著較強(qiáng)的保守性。

在蛋白性質(zhì)的研究中, 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的探究一直都與其半衰期長短相聯(lián)系。研究結(jié)果表明, 半衰期長則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高, 反之半衰期短則表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性低(賈浩等, 2011)。在本研究中, 獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的 EPO都具有較長的半衰期, 且屬于穩(wěn)定性蛋白, 將其與 EPO的穩(wěn)定性分析結(jié)果結(jié)合來看, 能夠確保獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚都屬于穩(wěn)定型親水性蛋白, 這也就表明了 EPO蛋白在體內(nèi)的生理功能發(fā)揮將會(huì)維持較穩(wěn)定的狀態(tài)。根據(jù)以往的研究表明, 成熟 EPO的某些螺旋區(qū)域能夠影響EPO的生物活性, 其主要原理是能夠增加蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的靈活度(Boisselet al, 1993)。而伯氏肩孔南極魚在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中的兩個(gè)小 β折疊區(qū)域能夠在確保不會(huì)影響 EPO的功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上, 潛在增加 EPO的生物活性。兩者的三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明南極冰魚的 EPO同哺乳動(dòng)物研究結(jié)果一致, 都是一個(gè)典型的4個(gè)反向平行的α螺旋折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成的球形分子(桂長云等, 1999; 葛全興等, 2009)。雖然獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的 EPO的理化性質(zhì)分析結(jié)果以及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測都能夠確保 EPO能夠正常行使其功能, 但是兩者之間由堿基突變造成的功能位點(diǎn)的改變對于該蛋白與受體的結(jié)合效率、轉(zhuǎn)運(yùn)、以及參與能量代謝過程的影響仍是一個(gè)有待深入研究的過程。該基因的成功克隆及分析為揭示南極冰魚EPO基因的遺傳特性以及生物在極端寒冷環(huán)境中的長期進(jìn)化適應(yīng)提供了理論依據(jù)。

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