杜新春， 宋艷玲， 龐 穎， 殷連保， 張 毅， 戴宏斌

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

獨角蓮多糖的提取及體外抗腫瘤活性研究

杜新春， 宋艷玲， 龐 穎， 殷連保， 張 毅， 戴宏斌

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

利用水提醇沉法從獨角蓮中提取多糖，Sevag 法除蛋白純化多糖，苯酚-硫酸分光光度法測定多糖的含量.采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測獨角蓮多糖對人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402抑制生長作用.結(jié)果表明:獨角蓮多糖具有一定的體外抗腫瘤活性，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制活性明顯加強(qiáng).

獨角蓮； 多糖； 抗腫瘤活性

多糖是一種廣泛存在于動物細(xì)胞膜和植物、微生物細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)，是一種重要的生物體能量資源和構(gòu)成材料，同時還參與細(xì)胞的多種活動.研究表明:許多植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗輻射和延緩衰老等生物活性[1-2].獨角蓮(TyphoniumgiganteumEngl.) 為天南星科(Araceae) 犁頭尖屬(Typhonium Schott) 植物，是中國特有的一種植物，現(xiàn)全國各地亦多栽培.獨角蓮中含有多種化學(xué)成分，例如甾類、脂肪酸、揮發(fā)油及多糖類化合物[3].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明:獨角蓮水提物及醇提物具有抗腫瘤、抗氧化等多種活性作用[4-7].本文利用水提醇沉法從獨角蓮中提取多糖成分，以苯酚-硫酸分光光度法測定多糖含量，通過對人肺癌A549腫瘤細(xì)胞、人肝癌Bel-7402腫瘤細(xì)胞體外抑制生長活性測試，初步研究獨角蓮多糖的體外抗腫瘤活性.

1 實驗材料與方法

1.1 儀器及試劑

721型分光光度計：上海光學(xué)儀器廠；DF1015-集熱式磁力加熱攪拌器、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器廠；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊新科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱：日本，三洋；離心機(jī)：上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀：深圳雷杜電子公司.

獨角蓮鮮球根莖：市售，產(chǎn)地吉林；葡萄糖：中國藥品生物制品檢定所；RPMI-1640：美國Gibco公司；鏈霉素、青霉素：美國HyClone公司；MTT：美國Sigma公司；10 %滅活的胎牛血清：天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；其他溶劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 獨角蓮多糖的提取和含量測定

獨角蓮鮮球根莖洗凈，切成約5 mm的厚片，經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，過60目篩，備用；稱取干燥的獨角蓮根莖粗粉100 g，加入體積分?jǐn)?shù)為80 %的乙醇1 000 mL，浸泡8 h，加熱回流提取2 h，過濾，藥渣干燥后，加入1 000 mL水回流提取2 h，重復(fù)3次，合并提取液.將合并的提取液濃縮至100 mL，加入400 mL乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉過夜.抽濾，濾餅依次用乙醇和丙酮洗滌，得到粗品多糖.將10 g粗品多糖溶于100 mL水中，加入V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1的混合溶液400 mL，混合物劇烈振搖30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)進(jìn)行3次.合并溶液，濃縮至100 mL，加400 mL乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉過夜.抽濾，濾餅依次用乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到獨角蓮多糖.

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，溶于蒸餾水并定容至100 mL.精確移取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，配成6個濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別移取6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于具塞試管中，每管加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為5 %的新制苯酚溶液，迅速加入濃 H2SO4后搖勻，靜置 5 min，沸水加熱30 min，用冰水冷卻至室溫，測定490 nm處各管中溶液的吸光度值.以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程.

稱取獨角蓮多糖10 mg，用蒸餾水溶解，定容至50 mL.精密移取此溶液1.0 mL于具塞試管中，根據(jù)苯酚-硫酸分光光度法測定吸光度，由回歸方程計算多糖樣品溶液中葡萄糖的濃度.

1.2.2 獨角蓮多糖體外抗腫瘤活性研究

細(xì)胞接種于體積分?jǐn)?shù)為10 %的滅活的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，在37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5 %的CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗，將細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜.多糖給藥組質(zhì)量濃度分別為1.0、10.0、100.0 g/L，每組均設(shè) 3個平行孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h.以MTT法測定波長490 nm處各孔的吸光度值(OD值)[8].腫瘤細(xì)胞存活率(SR)、腫瘤細(xì)胞抑制率(IR)根據(jù)以下公式計算：

SR=(OD給藥組/OD對照組)×100 %

IR=(1-SR)×100 %

2 結(jié)果與討論

2.1 獨角蓮多糖的含量測定結(jié)果

利用苯酚-硫酸分光光度法，對6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在 490 nm的波長處測定吸光度，結(jié)果見表1.

表1 6個不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液吸光度測試結(jié)果

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程.A=0.006 82ρ+0.003 4，r=0.998，葡萄糖在10～60 mg/L的濃度時與吸光度呈現(xiàn)出良好的線形關(guān)系.通過測定，獨角蓮多糖樣品溶液的吸光度A=0.114 2，利用回歸方程計算樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度為16.25 mg/L，以獨角蓮多糖中葡萄糖含量為標(biāo)準(zhǔn)，計算多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=16.25/200×100 %=8.12 %.

2.2 獨角蓮多糖對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402細(xì)胞的體外抑制活性

MTT檢測結(jié)果表明：獨角蓮多糖具有一定的抑制人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖的作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制活性明顯加強(qiáng)，見表2.

MTT檢測結(jié)果表明：獨角蓮多糖具有一定的抑制人肝癌細(xì)胞株Bel-7402細(xì)胞增殖的作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制活性明顯加強(qiáng)，見表3.

表2 獨角蓮多糖對人肺癌細(xì)胞株A549的生長抑制作用

注：a.對照組是生理鹽水；b.吸光度值在490 nm處測定.

表3 獨角蓮多糖對人肝癌細(xì)胞株

注：a.對照組是生理鹽水；b.吸光度值在490 nm處測定.

3 結(jié) 論

植物多糖類化合物具有抑制腫瘤生長、激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能等作用，已成為當(dāng)今新藥的發(fā)展方向之一.從中藥植物獨角蓮中提取出多糖，用苯酚-硫酸分光光度法測定其多糖含量，此法簡便易行，便于實際應(yīng)用.實驗表明：獨角蓮多糖對人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402具有一定抑制生長作用，因此，獨角蓮多糖具有較大的潛在應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步深入研究.

[1] 董群，方積年.多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36(10):649-651.

[2] 黃瑞松.中草藥多糖含量測定方法概述[J].中國藥師，2005，8(1):6870-6875.

[3] 胡長效，朱靜，孫曉靜.獨角蓮的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2007，27(2):50-54.

[4] 王順啟，倪虹，王娟，等.獨角蓮對肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)理的研究[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2003，25(3):185-187.

[5] 王順啟，倪虹，王問順，等.獨角蓮水提取物對肝癌細(xì)胞SMMC-7721基因表達(dá)的影響[J].中草藥，2006，37(9):1384-1387.

[6] 王林美，葉博，趙振軍，等.獨角蓮抑制乳腺癌 MCF-7細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40(2):174-177.

[7] 尹建元，樸春姬，楊建增，等.禹白附抗腫瘤活性研究(I)[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，16(2):52-53.

[8] 李榮輝，王玉，鄭麗紅，等.樹舌多糖抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及對EGFR表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(3):582-587.

Extraction of Polysaccharide fromTyphoniumGiganteum
Engl.and Its Anticancer Activities in Vitro

DU Xin-chun， SONG Yan-ling， PANG Ying， YIN Lian-bao， ZHANG Yi， DAI Hong-bin

(Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110042， China)

Polysaccharide was extracted fromTyphoniumgiganteumEngl.by water-extraction-alcohol-precipitation method，the deproteinization was performed by Sevag method，and the content of polysaccharide was deter mined by phenol sulfonic acid spectrophotometry.The antitumor activities ofTyphoniumgiganteumEngl.tuber polysacchayide in human Liver Cancer Bel-7402 and Lung Cancer A549 Cell Lines were measured by MTT method in vitro.The result suggestedTyphoniumgiganteumEngl.tuber polysacchayide could decrease the proliferation rate of Bel-7402 and A549 cells and cellular proliferation were inhibited with the increase of concentration and time.

TyphoniumgiganteumEngl.； polysacchayide； anticancer activity

2013-08-26

國家級“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”項目(201210149004)；遼寧省教育廳項目(L2012146)

杜新春(1992-)，女，遼寧普蘭店人，本科生在讀，主要從事天然產(chǎn)物生物活性研究.

宋艷玲(1977-)，女，吉林通化人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物生物活性研究.

2095-2198(2015)01-0007-03

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.01.002

R978.1

A