西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 (西安 710004)

康　瑛△　劉恩岐▲　鄭華東　李昭榮#

小鼠胚胎切割技術(shù)在人類輔助生殖中的應(yīng)用研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 (西安 710004)

康瑛△劉恩岐▲鄭華東李昭榮#

目的：探討將胚胎切割方法盡早應(yīng)用于臨床。方法：應(yīng)用顯微切割刀和酶消化透明帶顯微玻璃針分割兩種方法：對(duì)2、4、8細(xì)胞期和桑椹期的胚胎分割為二分胚；將2、4、8細(xì)胞期的胚胎切割成卵裂球；同時(shí)將2細(xì)胞期的胚胎連續(xù)2次分割培養(yǎng)；切割的二分胚和卵裂球在M16溶液中行胚胎體外培養(yǎng)，觀察其發(fā)育情況，達(dá)囊胚期植入子宮。結(jié)果：小鼠2、4、8細(xì)胞期的切割成功率分別為98.0%、86.6%、77.2%、66.1%，發(fā)育率為61.5%、80%、84.8%、89.3%；小鼠2、4、8細(xì)胞期切成的卵裂球發(fā)育至桑椹胚的成功率隨著細(xì)胞數(shù)的增多而減少。小鼠2細(xì)胞期卵裂球的全能性優(yōu)于4、8細(xì)胞期卵裂球。各細(xì)胞期半胚的發(fā)育率明顯好于卵裂球的發(fā)育率。連續(xù)有兩次切割2細(xì)胞期的胚胎發(fā)育到桑椹胚為15%。發(fā)育到囊胚的8細(xì)胞期和桑椹胚期的半胚移入假孕母鼠體內(nèi)妊娠率分別為33.3%和60%。結(jié)論：顯微玻璃針在切割成功率及后期的細(xì)胞成活率上優(yōu)于纖維切割刀的切割方法。

胚胎分割技術(shù)是指用人工方法將一個(gè)植入前的胚胎分割成兩個(gè)或多個(gè)部分，每一部分植入后發(fā)育成一個(gè)個(gè)體。Willadsen等[1]把這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于家畜,并在綿羊上獲得成功。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于家畜繁殖并取得了巨大的成功，并且在牛[2]、豬[3]、馬[4]、兔[5]等動(dòng)物上都獲得二份胚、四份胚的后代。1990年Eaton[6]首次利用藻酸鹽基質(zhì)代替透明帶來(lái)質(zhì)次放置的2-細(xì)胞期小鼠胚胎的體外發(fā)育，使單個(gè)卵裂球發(fā)育至胚泡期。本研究采用不同的胚胎分割方法切割受精卵成半胚及卵裂球，并將單個(gè)卵裂球轉(zhuǎn)入空的囊腔內(nèi)，進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察這兩種切割后的胚胎在體外的發(fā)育情況，待其發(fā)育到桑椹胚期后移入假孕母鼠體內(nèi)，對(duì)發(fā)育成個(gè)體的成功率進(jìn)行分析。

材料與方法

1試驗(yàn)材料ICR小鼠(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF動(dòng)物房飼養(yǎng),溫度控制在22±3℃,光控(12h明/12h暗),自由采食。Co60滅菌飼料(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；孕馬血清(PMS,寧波激素廠)；絨毛膜促性腺激素(hCG,上海第一生化制藥廠)；透明質(zhì)酸酶(美國(guó)Sigma司)；PBS、M16培養(yǎng)液均為自制；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab公司)；體視顯微鏡(日本Nikon公司)顯微手術(shù)器械；倒置顯微鏡(OLYMPUS IX-71)；纖維操作系統(tǒng)德國(guó)eppendof，拉針儀，斷針儀。

2方法

2.1超排卵及胚胎的收集：飼養(yǎng)于控光條件(光照∶黑暗=12h∶12h)下的5～8周齡ICR雌性小鼠,實(shí)驗(yàn)第一天注射孕母馬血清(PMSG)，于46～48h后給供體鼠注射絨毛膜促性腺激素(hCG) (0.5U/只)，hCG注射當(dāng)日(實(shí)驗(yàn)第3日)下午和雄鼠合籠，次日7:00～8:00檢查雌鼠有無(wú)陰栓以判定是否已經(jīng)交配，在實(shí)驗(yàn)的第5、6、7天分別取受精卵的2、4、8細(xì)胞期、囊胚期。

2.2胚胎分割針的制作：在拉針儀上,以外徑100mm的毛細(xì)玻璃管拉制分割針,分割針的細(xì)部長(zhǎng)約130μm ,并在其前端烤彎約120度角,切割部位直徑約1～5μm。

2.3纖維分割刀的制備：用剃須刀自治切割刀，將其與自制刀柄粘在一起，前面用于切割的部分最好不超過1mm，刀柄固定在纖維操作儀上。

2.4胚胎分割：對(duì)實(shí)驗(yàn)第5、6天的孕鼠處死后以PBS沖洗輸卵管，對(duì)實(shí)驗(yàn)第7天的孕鼠處死后用PBS沖洗輸卵管及子宮,在實(shí)體顯微鏡下,收集形態(tài)正常的2、4、8細(xì)胞期及桑椹胚期的胚胎用于分割試驗(yàn)。

2.4.1顯微刀分割法：用手術(shù)刀片在直徑35mm 塑料平皿蓋上刮出一小塊粗糙的平面(約2～4 mm)作為“分割床”,然后在其上覆蓋約200μl的分割液小滴。分割時(shí)將胚胎置于“分割床”上，刀刃對(duì)準(zhǔn)中線由上向下使囊胚、桑椹胚一分為二，對(duì)4、8細(xì)胞期的囊胚再進(jìn)行半胚切割直至為卵裂球，將卵裂球裝入準(zhǔn)備好的透明帶內(nèi)。

2.4.2顯微玻璃針分割法：首先用0.3%鏈酶蛋白酶處理后,直接在PBS液中進(jìn)行分割。分割時(shí),將胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一分為二，將分割的半胚分別在M16液中培養(yǎng)發(fā)育到桑椹胚再轉(zhuǎn)入到假孕母鼠體內(nèi)。將切割的單個(gè)卵裂球分別放入準(zhǔn)備好的透明帶內(nèi)，在M16液中培養(yǎng)發(fā)育到桑椹胚。

2.5體外培養(yǎng)：用自配的含20%的胎牛血清的M16在50×50mm的培養(yǎng)皿作20～30μl的微滴，每滴放入10～20個(gè)卵，微滴上覆蓋硅油，選擇分割后成活的單個(gè)胚胎及半胚放入液滴內(nèi)，移入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24～72h，觀察胚胎發(fā)育情況。

2.6假孕母鼠的準(zhǔn)備：將體重在18～25g的雌屬與結(jié)扎的公鼠合籠，第2天挑出有精栓的雌鼠作為移入的受體鼠備用，將發(fā)育到囊胚期的胚胎假孕母鼠體內(nèi)。

結(jié)　果

1不同分割方法的對(duì)比應(yīng)用顯微分割刀、顯微玻璃針兩種方法，將2、4、8細(xì)胞期的胚胎切割二分胚，發(fā)現(xiàn)兩種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的差異性，通過附圖可以看到酶消化透明帶顯微玻璃針分割成功率高于顯微刀切割，細(xì)胞切割的成功率隨細(xì)胞數(shù)的增加而減少。在隨后M16培養(yǎng)液中發(fā)育到桑椹胚期、囊胚期的發(fā)育率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, χ2=1.18)，隨著細(xì)胞數(shù)的增加其發(fā)育成功率也增加。

附圖兩種不同的切割方法切割2、4、8細(xì)胞期及桑椹胚期的細(xì)胞成功率比較

2兩種不同方法分割成單個(gè)卵裂球的比較4、8細(xì)胞期進(jìn)行卵裂球的切割時(shí)顯微玻璃針的切割成功率明顯高于顯微刀的切割成功率，4細(xì)胞期(χ2=6.338，P<0.05)、8細(xì)胞期(χ2=17.454，P<0.001)，小鼠2、4、8細(xì)胞期切成的卵裂球發(fā)育至桑椹胚的成功率隨著細(xì)胞數(shù)的增多而減少。小鼠的2細(xì)胞期的卵裂球的全能型優(yōu)于4、8細(xì)胞期的卵裂球。2細(xì)胞期切割成卵裂球的成活率及發(fā)育到桑椹胚期最高。

32細(xì)胞期的受精卵連續(xù)2次分割對(duì)20個(gè)2細(xì)胞期的受精卵連續(xù)兩次切割，發(fā)現(xiàn)最后有13個(gè)細(xì)胞發(fā)育到囊胚期，發(fā)育成功率15%，并且細(xì)胞形態(tài)良好。

4發(fā)育至桑椹胚期的卵轉(zhuǎn)入到假孕母鼠體內(nèi)的成功率分別選取發(fā)育到囊胚期的4細(xì)胞期和桑椹胚的半胚50、60個(gè)分別轉(zhuǎn)入3、5只假孕母鼠體內(nèi)，4細(xì)胞期直接的胚胎通過假孕母膨大的壺腹部注入到的輸卵管中段，桑椹胚期直接注入到子宮內(nèi)，孕20d，4細(xì)胞期有1只母鼠懷孕并產(chǎn)下2只小鼠，妊娠率33.3%。桑椹胚期有3只母鼠懷孕并產(chǎn)下9只小鼠，妊娠率60%。

討　論

目前，對(duì)于人類早期胚胎卵裂球發(fā)育和分化潛力的研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道早期胚胎的單個(gè)卵裂球具備進(jìn)一步發(fā)育和分化成完整、正常個(gè)體的潛能。胚胎卵裂球的全能性實(shí)驗(yàn)的研究主要表現(xiàn)在具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值：按需要從胚胎中取出卵裂球作遺傳病的早期診斷；從而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的；通過卵裂球植入胚胎可能治療單基因遺傳病[7]；卵裂球具有全能性可誘導(dǎo)發(fā)育成各種干細(xì)胞，將其冷凍作為以后治療某些疾病的手段；增加移植的胚胎數(shù)，提高體外受精的成功率。

胚胎分割所具有的優(yōu)點(diǎn)正被人類生殖遺傳學(xué)家廣泛關(guān)注[8]。胚胎分割常用的方法主要有：顯微手術(shù)刀或玻璃針切割胚胎；酶消化透明帶顯微玻璃針分割法。張涌等認(rèn)為顯微手術(shù)刀分割法最為理想，操作程序簡(jiǎn)化，用持卵器吸住胚胎，顯微手術(shù)刀直接分割，胚胎在室溫中暴露時(shí)間短利于胚胎的發(fā)育，操作熟練，每個(gè)胚胎約需1min左右。本試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析顯示兩種方法沒有明顯的差異性，從附圖可以看出顯微針切割的成功率明顯高于顯微刀的切割，因?yàn)轱@微手術(shù)刀直接分割胚胎時(shí)對(duì)卵裂球可能有損傷，尤其在操作較小的胚胎顯微刀的操作難度明顯加大。

Willadsen曾取牛8細(xì)胞期的胚胎的卵裂球培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其同卵雙胎及多胎的成功率明顯減少。本試驗(yàn)對(duì)ICR小鼠2、4、8三個(gè)細(xì)胞期的胚胎切割成單個(gè)卵裂球，分別培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)2細(xì)胞期卵裂球的發(fā)育和分化能力明顯大于4、8細(xì)胞期的卵裂球。并且4、8細(xì)胞期卵裂球的發(fā)育潛能下降，并有多數(shù)的卵裂球發(fā)育異常。4細(xì)胞期以后如果胚胎細(xì)胞的組成數(shù)量嚴(yán)重減少將阻礙胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。證實(shí)早期胚胎卵裂球進(jìn)一步發(fā)育和分化潛力的大小，取決于該細(xì)胞的細(xì)胞期和分化的程度，隨著發(fā)育過程的進(jìn)展，其發(fā)育潛力不斷降低；此外，細(xì)胞分化程度越低的卵裂球其發(fā)育成個(gè)體的可能性越大，4、8細(xì)胞期后卵裂球數(shù)量越少，發(fā)育程度越差。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)卵裂球的切割中顯微針的切割明顯優(yōu)于顯微刀的切割，可能與顯微針較細(xì)小切割過程中組織損傷少有關(guān)。

對(duì)比半胚和單個(gè)卵裂球發(fā)育成囊胚的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，半胚發(fā)育至桑椹胚明顯高于單個(gè)卵裂球的發(fā)育率，半胚體外培養(yǎng)，胚泡的發(fā)育率隨胚胎細(xì)胞數(shù)增多而提高，對(duì)于細(xì)胞數(shù)目越少的半胚在體外培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)育率越低。大多數(shù)半胚可發(fā)育成有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層的囊胚期，少數(shù)發(fā)育成假囊胚或滋養(yǎng)囊。用胚胎切割作植入前胚胎遺傳學(xué)診斷是一個(gè)非常好的方法，操作過程簡(jiǎn)便，細(xì)胞受損傷小，并且通過多次切割產(chǎn)生大量的受精卵，用于檢測(cè)植入前胚胎的發(fā)育情況。Karl等采用半胚切割能切割3次，第一、二次的胚胎切割成功率和發(fā)育率都很理想，為臨床解決這一問題提供了一種方法。

[1]Willadsen SM. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins[J]. Nature ,1979 ,227(25) : 298 - 300.

[2]Ozil JP,Heyman Y,Renard JP.Production of monozygotic twins by Micromanipulation and cervical transfer in the cow Vet[J].Rsc，1982,110:126-127.

[3]Nagashima H,Katoh Y.Production of normal piglet from microsurgical split morulae and blastocysts[J].Theriogenology,1988,29(2):485.

[4]Allen WR,Pashen RL.Production of monozygotic(identical) horse twins by embryo micromanipulation[J].Reprod Fertil，1984,71:607-613.

[5]Moore NW,Adams CE,Rowson LEA.Developmetal potential of singal blastomeres of the rabbit eggs[J]. Reprod Fertil，1968,17:527-531.

[6]Nancy LE,Glen PN,Michael CD.The use of an alginic acid matrix to support in vitor development of isolated murine blastomeres[J]. Journal of in vitro fertilization and embryo transfer, 1990,7(1):28-32.

[7]Illmensee K, Kaskar K, Zavos PM. In vitro blastocyst development from serially split mouse embryos and future implications for human assisted reproductive technologies[J]. Fertil Steril，2006，Suppl 4:1112-1120.

[8]Jones HW, Edward RG, Seidel GE. On attempts at cloning in the human[J]. Fertil Steril，1993，61:423- 426.

(收稿：2015-04-08)

胚胎分裂球動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)小鼠

R332

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.002

△陜西省婦幼保健院婦產(chǎn)科

▲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

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