西安市中心醫(yī)院(西安 710003) 杜旭升 黃妙毅 劉志燕 李建英

蒺藜總皂苷對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

西安市中心醫(yī)院(西安 710003) 杜旭升 黃妙毅 劉志燕 李建英

目的：探討蒺藜總皂苷(GSTT)對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響。方法：建立在體肺缺血再灌注模型。將30只大鼠隨機分為正常對照組(C組),缺血再灌注組(IR組),蒺藜總皂苷組(G組)。每組分別在再灌120min時處死10只大鼠,留取右肺組織,原位細胞凋亡檢測(TUNEL)法檢測肺組織中細胞凋亡指數(shù)(AI)及免疫組化法檢測肺組織Bcl-2、Bax蛋白的表達。結(jié)果：IR組肺組織AI、Bax/Bcl-2的表達均明顯升高,而預(yù)先給予GSTT干預(yù)后，G組均可以減弱缺血再灌注誘導(dǎo)上述指標的變化。結(jié)論：GSTT可通過下調(diào)Bax/Bcl-2蛋白表達,從而抑制細胞凋亡，對肺缺血再灌注損傷起到保護作用。

現(xiàn)已證實,細胞凋亡在肺缺血再灌注損傷(LIRI)中起著重要作用,過度凋亡可引起肺組織損傷,蒺藜總皂苷(GSTT)可通過抑制細胞凋亡而對心肌及缺血再灌注后腦組織起到保護作用[1]。本研究擬通過觀察GSTT對LIRI時細胞凋亡及其相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的影響,并探討其可能機制。

材料與方法

1 材 料 心腦舒通膠囊(蒺藜總皂苷粉,吉林敖東洮南藥業(yè)公司),凋亡檢測試劑(POD,北京中山生物技術(shù)有限公司),Bcl-2、Bax 抗體(美國Santa cruz 公司),SABC過氧化物酶試劑盒購自武漢博士德公司,PBS 緩沖液：自行配制,每升中含8g NaCl,0.2gKCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4，pH調(diào)至7.4,余為市售純試劑, 30只雄性Wistar大鼠,體重220～240g(山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)。

2 方 法 ①動物分組：實驗大鼠隨機分為3組,每組10只。正常對照組(C組)：開胸游離右肺門后,不行夾閉阻斷。缺血再灌注組(IR組)：開胸游離右肺門后,夾閉阻斷45min,繼行再灌注120min。蒺藜總皂苷組(G組)：GSTT 以67.5 mg/kg灌胃，1次/d,連續(xù)10d,第10次灌胃后1h 行手術(shù), 其余操作同IR 組。C 組和IR 組采用與G組相同時點與方法灌入等量生理鹽水。②模型的建立：采取既往研究的建模方法[2],制成在體肺缺血再灌注模型,各組分別于再灌120min后處死大鼠,留取右肺中葉作為標本。③肺組織細胞凋亡指數(shù)(AI)檢測：采用原位缺口末端標記法(TUNEL),按照試劑盒說明書對右肺中葉凋亡細胞進行定量檢測，細胞核呈棕黃色為陽性細胞，高倍鏡下(×400)隨機選擇10個視野觀察陽性細胞,AI即為陽性細胞所占百分數(shù)。④免疫組化SABC法檢測肺組織Bcl-2、Bax蛋白：肺組織切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,復(fù)合消化液暴露抗原,封閉非特異性抗原后滴加1∶100稀釋的1抗，37℃1h,陰性對照為PBS替代1抗；滴加山羊抗兔II抗IgG,37℃20min；滴加SABC,37℃ 20min；DAB顯色3min，然后蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。鏡檢：顯色呈棕黃色為陽性表達。使用彩色圖像分析系統(tǒng)測定吸光度值。

結(jié) 果

1 肺AI的變化 見附表。在再灌120min時，IR組AI明顯升高，給予GSTT干預(yù)后G組AI均較IR明顯降低(P<0.05)。

2 肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達 見附表。在再灌120min時，C組Bax蛋白表達多于Bcl-2蛋白,其比值Bax/Bcl-2小于1，IR組Bax、Bcl-2均較C組升高(P<0.05),且以Bax升高顯著。G組Bax較IR組顯著降低,而Bcl-2較IR組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

附表 各組再灌120min時AI、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2比較

注： 與C組比較，△P<0.05；與IR組比較,▲P<0.05

討 論

LIRI是個復(fù)雜的病理生理過程，氧自由基的釋放、中性粒細胞浸潤、細胞凋亡等參與其發(fā)病過程[3]。我們既往研究曾報道過蒺藜總皂苷可通過抗氧化及抗中性粒細胞聚集對LIRI起到保護作用[2]，現(xiàn)在通過對肺組織AI、Bax、Bcl-2的檢測，來研究GSTT的抗凋亡作用。Fischer 等[4]報道在肺缺血期僅少數(shù)細胞發(fā)生凋亡，但隨著再灌注的開始，凋亡細胞逐漸增多，約在再灌注2h凋亡細胞數(shù)目達到峰值?；诖吮緦嶒炗谠俟嘧?20min時采取標本檢測凋亡相關(guān)指標。本實驗顯示，IR組TUNEL檢測到的大量黃染的凋亡細胞，給予GSTT干預(yù)后，G組的AI較IR明顯減小，提示GSTT可減輕LIRI時細胞凋亡。

細胞凋亡受多基因嚴格掌控，其中Bcl-2基因家族在其中發(fā)揮著重要的作用,其成員包括以Bcl-2為代表的抗凋亡基因及以Bax為代表的促凋亡基因，兩者通過二聚體化過程調(diào)節(jié)細胞凋亡[5]。當肺缺血再灌注時Bax等促凋亡蛋白明顯增加，而Bcl-2等抑制凋亡蛋白增加不明顯，進而形成Bax/Bax同源二聚體,誘導(dǎo)細胞凋亡。當氧化應(yīng)激減輕后，Bcl-2等抑制凋亡蛋白逐漸增多，Bax等促凋亡蛋白相應(yīng)減少，Bax/Bax同源二聚體逐漸解離，與Bcl-2形成Bax/Bcl-2異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[6-7]。本實驗可見，IR組Bax升高同時，Bcl-2也較C組有所升高，可能與肺細胞受到刺激后，代償性反應(yīng)所致，是一種機體自我保護的形式，但其作用有限，仍以Bax升高占優(yōu)勢，Bax/Bcl-2比值增大；給予GSTT干預(yù)后，雖然G組的Bax下降明顯，而Bcl-2則升高顯著，Bax/Bcl-2比值明顯減小，提示GSTT可通過上調(diào)Bcl-2蛋白及下調(diào)Bax蛋白，從而減輕細胞凋亡。

氧化應(yīng)激可促進凋亡的發(fā)生和發(fā)展[5]，我們既往研究顯示GSTT可通過抗氧自由基的釋放對LIRI起到保護作用，結(jié)合本研究結(jié)果，可見GSTT可通過直接調(diào)控凋亡基因的表達及間接抗氧化，從而減少細胞凋亡，對LIRI起到保護作用。

[1] 郭 艷,殷惠軍,史大卓,等.心腦舒通膠囊對高脂血癥大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,26(6)：541-544.

[2] 杜旭升,趙 卉,李建強.蒺藜總皂苷對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].臨床醫(yī)藥實踐雜志,2008,17(2)：94-96.

[3] Gennai S, Pison C, Briot R.Ischemia-reperfusion injury after lung transplantation[J]. Presse Med, 2014，43(9)：921-30.

[4] Fisher S,Cassivi SD,etal.Cell death in human lung transplantation：Apoptosis induction in human lung during ischemia and after transplantation[J].Ann Thorac Surg，2011,231：424-431.

[5] 馮冬杰,許 林.凋亡在肺缺血再灌注損傷中作用機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2010，23(2)：214-217.

[6] Chen HE，Ma YC，He JB.Ischemic postconditioning attenuates pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion injury via inactivation of p38 MAPK[J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi, 2014,30(3)：251-256.

[7] Rivo J，Zeira E,Galun E.Attenuation of reperfusion lung injury and apoptosis by A2A adenosine receptor activation is associated with modulation of Bcl-2 and Bax expression and activation of extracellular signal-regulated kinases[J].Shock,2007,27(3)：266-273.

(收稿：2014-11-16)

The effects of gross saponin from tribulus terrestris on apoptosis in

lung ischemia-reperfusion injury

Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003) Du Xusheng Huang Miaoyi Liu Zhiyan et al

Objective：To investigate the effects of gross saponin from tribulus terrestris(GSTT) on pneumocyte apoptosis in lung ischemia-reperfusion injury.Methods：Thirty healthy rats were randomly divided into three groups：C group,IR group,G group. After 120 min reperfusion,TUNEL assay was applied to detect lung apoptotic index(AI) and immunohi stochemical SP technique was used to detect the expressions of Bcl-2 and Bax protein. Results:GSTT could decrease AI(P<0.05),and lower Bax protein expression(P<0.05)．Conclusion：GSTT can reduce lung apoptosis through regulating protein expressions of Bcl-2 and Bax,so that it provides significant protective effects on lung ischemia-repe rfusion injury.

Lung Reperfusion injury Apoptosis Genes,bcl-2 @Tribulus terrestris

肺 再灌注損傷 細胞凋亡 基因,bcl-2 @蒺藜總皂苷

R563.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.007