王春柳 龍凱花 楊 潔 辛永潔 李彤暉 李 曄

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

鴉膽子油自微乳化顆粒急性毒性及協(xié)同抗腫瘤作用*

王春柳 龍凱花 楊 潔 辛永潔 李彤暉 李 曄△

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

目的：鴉膽子油自微乳化顆粒急性毒性試驗及其協(xié)同抗腫瘤作用研究。方法：以相當于14.4g鴉膽子油/kg劑量進行小鼠急性毒性試驗，觀察14d內(nèi)小鼠毒性反應；考察鴉膽子油自微乳化顆粒1g鴉膽子油/kg劑量對環(huán)磷酰胺(CTX)和氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180實體瘤的增效作用。結(jié)果：鴉膽子油自微乳化顆粒未測出LD50，在約576倍人體劑量下,連續(xù)觀察14d，未觀察到小鼠急性毒性反應；鴉膽子油自微乳化顆粒在相當于1g鴉膽子油/kg劑量下與環(huán)磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)合用具有協(xié)同增效作用。結(jié)論：鴉膽子油自微乳化顆粒在所考察劑量下無明顯急性毒性，具有與環(huán)磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)協(xié)同抑瘤作用。

鴉膽子油是從苦木科植物鴉膽子干燥成熟果實中提取的脂肪油，現(xiàn)代藥理學研究證明具有抗腫瘤作用[1]。鴉膽子油臨床常用劑型鴉膽子油乳注射液、鴉膽子油口服乳劑存在穩(wěn)定性差、不良反應大，有毒性等問題[2]。針對以上問題本課題組前期進行了鴉膽子油固體自微乳制劑開發(fā)研究，前期對該新型制劑的體外釋放行為、質(zhì)量標準、藥代動力學性質(zhì)、抗腫瘤作用進行了研究及報道[3-4]。本文對自制鴉膽子油自微乳化顆粒的安全性及協(xié)同抗腫瘤作用進行了研究與探討，為鴉膽子油臨床用藥開發(fā)提供參考。

1 實驗材料 1.1 實驗動物 昆明種小鼠體重18～22g，雌雄各半，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[合格證號：NO 0022211，生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2007-007]。實驗前飼養(yǎng)1周，選行為活動、飲食、精神狀況正常的小鼠進行實驗。

1.2 儀器與材料 電子天平(型號：BS210S，精確度：0.1mg)；普通光學顯微鏡(olympus )；顯微鏡(XSZ-D2，9818504)；恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus)；鴉膽子油自微乳顆粒劑為實驗室自制(批號為：20120218，每袋30g，每袋含鴉膽子油0.5g)；注射用環(huán)磷酰胺(國藥準字H32020857，批號11052821)；氟尿嘧啶注射液(國藥準字H31020593，批號：110608)；人肺癌A549瘤株由中國醫(yī)學科學院藥物研究所引進，人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

2 實驗方法 2.1 鴉膽子油自微乳化顆粒對小鼠的急性毒性試驗研究 2.1.1 預試：自制鴉膽子油自微乳化顆粒人體服用劑量以鴉膽子油計為0.025g鴉膽子油/kg/d(人體重按60kg計)。試驗時將鴉膽子油自微乳化顆粒配制成鴉膽子油自微乳，按照藥液最大濃度進行灌胃預試。給藥劑量(以鴉膽子油計，下同)為大劑量14.4g鴉膽子油/kg/d、中劑量7.2g鴉膽子油/kg/d、小劑量3.6g鴉膽子油/kg/d。取18～22g健康小鼠10只，給藥前禁食12h，按0.4mL/10g的最大給藥體積，24h內(nèi)灌藥3次，給藥后觀察小鼠一般情況，連續(xù)3d。

2.1.2 最大耐受量試驗：取18～22g健康小鼠40只，隨機分為正常對照組及給藥組，每組各20只小鼠(雌雄各半)，給藥前禁食12h，給藥組按照14.4g鴉膽子油/kg/d劑量給藥，以0.4mL/10g的灌胃體積在24h內(nèi)灌胃3次，對照組給與同體積賦形劑，連續(xù)觀察14d，詳細記錄小鼠行為活動、狀態(tài)、飲食、大小便及毛色、分泌物等，末次給藥后處死，進行尸檢。

2.2 鴉膽子油自微乳劑對環(huán)磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180實體瘤的增效作用 取昆明種小鼠60只，體重20±2g，雌性。在超凈臺內(nèi)制備瘤細胞懸液，每只小鼠右腋皮下注射0.2mL，計瘤細胞數(shù)約為2.0×106瘤細胞。24h后隨機分為6組，各組10只。模型組灌胃給予純凈水 20mL/kg；鴉膽子油自微乳顆粒組按照1g鴉膽子油/kg劑量灌胃；環(huán)磷酰胺組按照CTX 20mg/kg 灌胃；氟尿嘧啶組按照5-Fu 20mg/kg灌胃；鴉膽子油自微乳顆粒合環(huán)磷酰胺組按照 1g鴉膽子油/kg、CTX 20mg/kg灌胃 ；鴉膽子油自微乳顆粒、氟尿嘧啶組按照1g鴉膽子油/kg 、5-Fu 20mg/kg灌胃；以上劑量每日灌服1次，等容量20mL/kg。末次給藥后第二天稱體重、測瘤重、計算腫瘤抑制率，再根據(jù)nuebb氏分數(shù)成績法計算試藥加化療藥組的理論效應，當合并用藥效應大于理論相加效應時，表示它們有協(xié)同作用。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%.nuebb氏分數(shù)成績法：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]，(fa)1和(fa)2分別為試藥和化療藥的抑瘤率。

3 結(jié) 果 3.1 鴉膽子油自微乳化顆粒對小鼠的急性毒性試驗研究 連續(xù)觀察：3 d，小鼠大便正常，無死亡，活動自如，進食、飲水正常，也無明顯中毒反應，未測出LD50，故選擇14.4g鴉膽子油/kg劑量進行最大耐受量試驗。給藥后：小鼠大便正常呈濕潤顆粒狀，無死亡，活動自如，進食、飲水均正常，皮毛光潔，口、鼻、眼及肛門清潔無分泌物，兩周內(nèi)體重與對照組相比無顯著性差異(P> 0.05)，結(jié)果見表1。解剖后胸腔、腹腔未見異常液體，腸管未見脹氣，心、肝、脾、肺、腎等重要臟器未見顏色、形態(tài)異常，沒有出血點或其它病理改變，胃黏膜顏色紅潤，無出血點或潰瘍，尸檢無異常。因此擬定鴉膽子油自微乳化顆粒劑小鼠最大受試藥物量為：以鴉膽子油計14.4g鴉膽子油/kg，約為自擬臨床用量的576倍。在此劑量下未觀察到鴉膽子油自微乳的急性毒性反應。

表1 給藥前后小鼠體重

3.2 鴉膽子油自微乳劑對環(huán)磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180實體瘤的增效作用 結(jié)果見表2、表3，動物數(shù)始末相同，給藥過程無死亡。由表2、表3結(jié)果可知，在實驗過程中，給藥組小鼠體重與模型組無顯著差異；環(huán)磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)及鴉膽子油自微乳化顆粒與環(huán)磷酰胺(CTX)或氟尿嘧啶(5-Fu)合用組小鼠瘤重與模型組相比，均顯著降低(P< 0.01)。鴉膽子油自微乳劑1g鴉膽子油/kg劑量加CTX閾下量合并用藥的抑制率53%大于理論相加效應50%，表明鴉膽子油自微乳劑與環(huán)磷酰胺有協(xié)同增效作用；鴉膽子油自微乳劑1g鴉膽子油/kg劑量加5-Fu閾下量合并用藥的抑制率89%大于理論相加效應88%，表明鴉膽子油自微乳劑與氟尿嘧啶有協(xié)同增效作用。

表2 鴉膽子油自微乳劑對環(huán)磷酰胺(CTX)抗S180肉瘤的增效作用

注：與模型組比較 ，△P< 0.01

表3 鴉膽子油自微乳劑對氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180肉瘤的增效作用

注：與模型組比較，△P<0.01

4 討 論 有報道鴉膽子油乳注射液為LD50為6.25g/kg，另有研制鴉膽子油亞納米乳注射液，其LD50為7.388g/kg[5]。本課題組研制的鴉膽子油自微乳顆粒在14.4g /kg(以鴉膽子油計)即約576倍人體劑量下無明顯急性毒性反應，未測出LD50，說明其安全性較文獻報道劑型有所提高。本課題組前期研究表明鴉膽子油自微乳化顆粒在體外生物利用度較口服乳劑高，鴉膽子油自微乳在體外能夠顯著抑制肺癌A549細胞的增值[6-7]。本文研究證明鴉膽子油自微乳化顆粒的安全性較高，且與環(huán)磷酰胺(CTX)及氟尿嘧啶(5-Fu)均具有協(xié)同抗腫瘤作用。以上研究結(jié)果可為鴉膽子油自微乳化顆粒后續(xù)研究乃至臨床研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 張凌云. 鴉膽子與混偽品的鑒別[J].陜西中醫(yī),2012,33(5):612-613.

[2] 謝秋紅. 1例鴉膽子油乳注射液引起速發(fā)型過敏反應救護體會[J].中國老年保健醫(yī)學,2011,9(3):102.

[3] 馬海萍,戴學棟,戴曉莉，等. 鴉膽子油乳注射液大鼠長期毒性實驗研究[J].中國藥物警戒,2013,10(6):330-333.

[4] 蔣 楠,李 曄,陳 鋼，等. 鴉膽子油自微乳的制備及溶出度考察[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(9):45-48.

[5] 李彤暉,李 曄,陳 鋼,等. 鴉膽子油自微乳化顆粒質(zhì)量控制方法研究[J].中國實驗方劑學雜志2014,20(8):89-92.

[6] 李 曄,孫 雯,蔣 楠，等. 鴉膽子油自微乳化顆粒大鼠體內(nèi)生物利用度考察[J].中成藥,2014,36(12):2615-2617.

[7] 楊 潔,趙林濤,李 凡，等. 鴉膽子油自微乳劑對肺癌A549細胞增殖的抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學學報,2012,33(8):928-930.

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

抗腫瘤藥 鴉膽子

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.058

*陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(2009ZDKG-82)

△通訊作者