朱昌玲，孫達(dá)鋒

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

豆渣水溶性多糖的精制及抗氧化活性研究

朱昌玲，孫達(dá)鋒*

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

豆渣；水溶性多糖；精制；抗氧化活性

大豆是我國七大糧食作物之一，有資料表明豆渣中碳水化合物的含量為60%～70%，豆渣作為一種廉價(jià)的大豆類工業(yè)的副產(chǎn)品，是多糖提取的理想原料。水溶性大豆多糖(Water-soluble Soybean Polysaccharides)簡(jiǎn)稱大豆多糖，主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、海藻糖等，是一種具有多種生物功能活性的天然酸性多糖，是大豆中的有效活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功效，有著良好的生理保健功能。已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，發(fā)達(dá)國家十分重視其開發(fā)利用研究，并已有許多產(chǎn)品面市[1-4]。目前，國內(nèi)關(guān)于豆渣水溶性多糖方面的研究報(bào)道很少，因此對(duì)豆渣水溶性多糖的提取、精制及其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，將為豆渣多糖在天然抗氧化劑和功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮豆渣，購于菜市場(chǎng)，烘干粉碎備用；淀粉酶型號(hào)為640034361；中性蛋白酶購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；試劑均為分析純或化學(xué)純。

主要儀器：6SH-1反應(yīng)釜(威?；て餍涤邢薰旧a(chǎn))；SP-75系列紫外可見光分光光度計(jì)； HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋； JJ-1電動(dòng)攪拌器； WH-1微型旋渦混合儀；DL-102A型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 豆渣水溶性粗多糖的制備方法

稱取一定量的干豆渣，加水?dāng)噭?，倒入高溫反?yīng)釜進(jìn)行高溫蒸煮，控制蒸煮時(shí)間為90 min，蒸煮溫度為135 ℃；反應(yīng)結(jié)束后，用濾布進(jìn)行粗過濾，再將濾液在3 000 r/min下離心15 min得上清液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，干燥得水溶性粗多糖。

1.2.2 豆渣水溶性多糖的精制方法

精制工藝流程：豆渣粗多糖→脫脂→淀粉酶水解→蛋白酶水解→離心、濃縮、醇沉、干燥→豆渣多糖。

脫脂處理：用適量的乙醚(或石油醚)浸泡，除脂肪。

淀粉酶水解：配制濃度為10%的豆渣粗多糖溶液，加0.5%中溫淀粉酶，70 ℃水解4 h。

蛋白酶水解：加入0.5%中性蛋白酶， 60 ℃下水解3 h，水解結(jié)束后進(jìn)行滅酶處理。

離心、濃縮、醇沉、干燥：離心得上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，按其3倍體積加入95%乙醇，4 ℃靜置沉淀8 h，抽濾、真空干燥。

1.2.3 多糖的測(cè)定方法

總糖的測(cè)定：苯酚-硫酸法[5]；還原糖的測(cè)定： DNS法[6]。

按以下公式進(jìn)行計(jì)算 多糖含量(mg/mL)=總糖含量(mg/mL)-還原糖含量(mg/mL)

多糖的純度(%)=(多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量)×100，其中多糖質(zhì)量(g)=多糖含量(mg/mL)÷1 000×體積(mL)

1.2.4 多糖對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用的測(cè)定方法[7]

向試管中加入一定體積的濃度為2 mg/mL的樣品，再加入6.0 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，最后用蒸餾水補(bǔ)足至9 mL，搖勻，于37℃水浴10 min。取出后加入37 ℃預(yù)熱過的3.5 mmol/L鄰苯三酚溶液1.0 mL，精確反應(yīng)6 min，立即用0.5 mL 8.0 mol/L的濃鹽酸終止反應(yīng)，于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算清除率，同時(shí)以0.2 mg/mL的抗壞血酸代替樣品作為陽性對(duì)照。

1.2.5 多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力的測(cè)定方法[7]

在試管中依次加入一定體積的濃度為1 mg/mL樣品， 9 mmol/L的FeSO4-EDTA溶液1 mL， 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL (空白不加)，最后各管再加8.8 mmol/L H2O21 mL，各管用蒸餾水足至5 mL，搖勻，于510 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算清除率，同時(shí)以等體積、等濃度的抗壞血酸代替樣品作為陽性對(duì)照。

1.2.6 多糖還原力的測(cè)定方法[7]

向試管中加入一定體積濃度為1 mg/mL的樣品，用磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH6.6)補(bǔ)足至2.5 mL。再加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀，置于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min。再加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，混合后在3 000 r/min下離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的FeCl3溶液，搖勻，10 min后測(cè)定其在700 nm處的吸光值，吸光度值越大表示還原力越強(qiáng)。同時(shí)以等體積的0.1 mg/mL的BHT代替樣品作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣水溶性多糖精制前后純度對(duì)比

表1 豆渣水溶性多糖精制前后多糖純度對(duì)比

水溶性豆渣粗多糖雜質(zhì)多，性能不穩(wěn)定，需要進(jìn)行精制得到性能優(yōu)良的水溶性豆渣多糖。由表1可以看出，豆渣水溶性粗多糖通過精制處理后純度得到了明顯提高。因?yàn)槊杆饽苊摮渲信c多糖分子緊密結(jié)合的非糖類成分。

超氧陰離子自由基是在生命活動(dòng)的代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的自由基,具有很強(qiáng)的氧化能力[8]。由圖1可以看出，豆渣多糖對(duì)鄰苯三酚法反應(yīng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基具有明顯的清除作用，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。圖1還顯示了濃度為2 mg/mL的豆渣多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除與濃度為0.2 mg/mL的抗壞血酸的對(duì)比關(guān)系。

圖1 豆渣多糖對(duì)·清除能力

2.3 豆渣多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

羥基自由基是最活潑的自由基,也是毒性最大的自由基,它可以與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)造成損害,且反應(yīng)速度極快,被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機(jī)酸等[8]。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，水楊酸法檢測(cè)羥基自由基及物質(zhì)清除羥基自由基的能力。在此法中，羥基自由基進(jìn)攻水楊酸分子的苯環(huán)產(chǎn)生能用分光光度法測(cè)量的羥基化合物2，3-二羥基苯甲酸，可用該產(chǎn)物生成的多少來描述羥基的量及待測(cè)物質(zhì)清除羥基自由基的能力。從圖2可以看出，豆渣多糖對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)的羥基自由基具有明顯的清除作用，但對(duì)羥基自由基的清除能力不及等濃度的抗壞血酸。

圖2 對(duì)·OH清除能力

2.4 豆渣多糖還原力的測(cè)定結(jié)果

物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關(guān)性，還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。由圖3可以看出，豆渣多糖具有較強(qiáng)的還原力，且呈一定的量效關(guān)系，但本實(shí)驗(yàn)條件下多糖的還原力不及BHT。

圖3 豆渣多糖還原力測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

(1)豆渣水溶性粗多糖通過脫脂、酶解精制處理后，多糖的純度得到了明顯提高，由74.60%提高到了87.45%。

[1] 譚永輝,王文生,秦玉昌,等.豆渣中水溶性大豆多糖的提取與應(yīng)用[J].大豆科學(xué),2008(1):150-153.

[2] 范遠(yuǎn)景,張倩,朱昺.豆渣中水溶性大豆多糖提取及組分鑒定[J].食品科學(xué),2007(1):295-298.

[3] 周麗珍,劉冬,李艷,等.高溫蒸煮結(jié)合酶解改性豆渣膳食纖維[J].食品研究與開發(fā),2011(1):27-30.

[4] 宋慧,苗敬芝,董玉瑋. 雙酶法提取大豆多糖及其抗氧化性研究[J].中國食品添加劑,2011(5)：89-93.

[5] 張維杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].2版.杭州:浙江大學(xué)出版社,1999:244-246.

[6] 陳毓荃.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2005:97-100.

[7] 張強(qiáng),宮璐嬋,孟凡榮,等.雙孢菇多糖抗氧化活性的研究[J].中國林副特產(chǎn),2010(1):16-19.

[8] 張強(qiáng),牟雪姣,周正義,等.豆渣多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2007(5):49-52.

Refining Water-soluble Polysaccharides from Bean Dregs and Their Antioxidant Activity

Zhu Changling, Sun Dafeng*

(Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China)

Bean dregs of water-soluble polysaccharide after degreasing, enzyme hydrolysis are refined polysaccharide purity from 74.60% to 87.45%; Through the test of water-soluble polysaccharide of bean dregs to O2-inhibition and ·OH scavenging ability as well as the determination of reducing power, it showed good antioxidant activity.

bean dregs; water-soluble polysaccharide; refining; antioxidant activity

2014-11-21

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2012044)。

朱昌玲(1968—)，女(漢族)，高級(jí)工程師，本科。研究方向：生物工程。

*通訊作者：孫達(dá)鋒。E-mail:sdafeng@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.018

TS202

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1006-9690(2015)03-0069-03