胡仲義，吳　帆，徐兵兵，張　晶，戴智慧，倪　穗*

(1.寧波城市職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315502；2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

不同地區(qū)麥冬遺傳多樣性的ISSR分析

胡仲義1，吳帆2，徐兵兵2，張晶2，戴智慧2，倪穗2*

(1.寧波城市職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315502；2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

利用ISSR分子標記技術對5個地區(qū)6個麥冬居群進行遺傳多樣性分析。選用10條擴增帶型清晰且重復性好的引物進行擴增，共獲得115條帶，其中89條具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為77.39%。當遺傳相似系數(shù)(GS)為0.61時，可將6個麥冬居群分為2大類群。居群的GS平均值為0.643，表明供試居群之間存在較近的親緣關系，且地域越近的其親緣關系關系越近。研究表明ISSR分子標記技術能夠很好地用于不同地域同種物種的親緣關系分析。

麥冬； ISSR-PCR； 親緣關系； 遺傳多樣性

麥冬(Ophiopogonjaponicus)為百合科沿階草屬多年生草本植物。中醫(yī)學上以麥冬地下塊根入藥。臨床證明，麥冬塊根對肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥具有很好的療效[1]。根據(jù)麥冬產(chǎn)地不同，可將麥冬分為四川麥冬、湖北麥冬、浙麥冬等品系。近年來，對這三種麥冬的研究大多數(shù)都著眼于其內部的化學成分、藥理毒理、數(shù)量遺傳性狀等方面[2-4]，對三者種質資源鑒定和其遺傳多樣性的研究較少。

ISSR(inter-simple sequence repeats，簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性)技術是1994年發(fā)展起來的一項基于微衛(wèi)星技術的新型的分子標記技術。相對于RAPD和SSR分子標記而言，ISSR引物具有更高的退火溫度，從而保證了更高的穩(wěn)定性和重復性。此外，由于ISSR所使用的引物為非特異性引物，故不需要預先知曉序列信息，既可以節(jié)約人力物力成本。由于ISSR的簡便快捷，近年來其已經(jīng)應用于植物親緣關系、指紋圖譜及種質資源遺傳多樣性等領域的研究。本實驗以四川麥冬、浙麥冬和湖北麥冬為研究對象，利用ISSR分子標記方法研究三種麥冬品系的遺傳多樣性。以期為各地麥冬的種植、資源保護和優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料來源于湖北武漢、湖北襄陽、浙江慈溪、四川成都、貴州遵義等地，采其新鮮幼嫩葉片并對不同居群標號(表1)，用無菌水洗凈后晾干，裝入滅菌離心管內，封口膠封口，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

表1　實驗材料產(chǎn)地及類型

1.2主要試劑與儀器

試劑：十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、Tris-HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，氯仿、異戊醇等均為分析純；2×Easy Taq PCR Supermix (+dye)；ISSR引物(華大基因合成)；超純水。

儀器：冷凍離心機(Sigma)、電泳儀(北京六一儀器廠)、超凈工作臺、水浴鍋、PCR儀、UVP凝膠成像系統(tǒng)。

1.3實驗方法及步驟

1.3.1麥冬總DNA提取

由于麥冬葉片中含有大量的多糖、酚等物質，若采用傳統(tǒng)CTAB法進行實驗則會因為雜質太多而降低DNA的純度。故參考王冠明[5]等的方法，經(jīng)過多次實驗摸索出適合麥冬的改進CTAB法。

具體操作步驟如下：取新鮮幼嫩的麥冬葉片于預冷的研缽中，加入少量PVP粉末和石英砂，加入液氮迅速研磨至樣品徹底成為粉末，后迅速轉移至2 mL預冷離心管中，加入1.5 mL預冷的核分離液 (250 mmol/L NaCl，200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，2% PVP (w/v)，1%巰基乙醇(v/v))，混合均勻后冰上靜置20 min。4 ℃下3000 r/min離心5 min，棄上清液和膠狀粘稠物質及壁上殘留。若上清液顏色較深則重復抽提一次。在沉淀中加入700 μL 65 ℃預熱的CTAB緩沖液、14 μL β-巰基乙醇，65 ℃水浴40 min。期間輕搖離心管數(shù)次，后4 ℃10 000 r/min離心10 min。將上清液轉移至新的2 mL預冷滅菌離心管內，加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕上下顛倒2 min，靜置5 min后4 ℃10 000 r/min離心10 min。后重復此步驟一次。取上清液于新的2 mL預冷滅菌離心管內，加入2.5倍體積的-20 ℃預冷的無水乙醇。上下輕輕顛倒至完全混合均勻后-20 ℃冷凍過夜。后4 ℃10 000 r/min離心10 min，1 mL -20 ℃預冷的無水乙醇洗滌沉淀一次，再4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。加入200 μL滅菌超純水將固體溶解，-40 ℃冷凍備用。

1.3.2引物篩選

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列以及總DNA電泳結果，選取兩組條帶清晰、含量較高的麥冬DNA對20條ISSR引物進行篩選，從中篩選出擴增條帶清晰、重復性好的10條引物，隨后用這些引物對所有個體進行PCR擴增。PCR體系如下：

Primer0.4μL

2×Supermix10μL

DNA0.4μL

ddH2O補至20μL

PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，在適當退火溫度下退火30 s，72 ℃鏈延長2 min，35次循環(huán)后充分延長7 min，最后在12 ℃下保存。將擴增后的樣品點樣于1.5%瓊脂糖凝膠上加Gel Red染色劑，120V電泳1-1.5h，并將成像條帶拍攝、儲存，供分析時使用。

表2　ISSR引物及退火溫度

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用人工計數(shù)法進行電泳結果記錄。根據(jù)電泳結果記錄清晰可重復的電泳條帶，對同一引物的擴增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為一個位點。擴增有帶記為1，擴增無帶記為0。利用NTSYS2.1軟件按基于Nei-Li遺傳相似系數(shù)的UPGMA法進行計算，GS=m/(m+n)。其中GS為遺傳相似系數(shù)，m為基因型間共有條帶的數(shù)目，n為差異條帶的數(shù)目。遺傳距離GD=1-GS，采用UPGMA進行聚類分析，構建樹狀圖。

2　結果與分析

2.1麥冬葉片總DNA的提取

利用經(jīng)過改良的CTAB法對麥冬葉片進行總DNA提取，結果表明，改良后的CTAB法能夠有效地提取麥冬葉片中的DNA。經(jīng)測定，所有DNA的OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0之間；同時電泳結果表明，每一組DNA的含量均符合PCR擴增的要求。

2.2ISSR多態(tài)性分析

利用篩選出的10條ISSR引物對各地麥冬DNA進行擴增，結果表明，10條ISSR引物一共擴增出115條帶，片段長度大約在250 bp至2 000 bp之間。其中多態(tài)性條帶89條，占總條帶數(shù)(115條)的77.39%，平均每條引物擴增11.5條帶。實驗證明麥冬基因組DNA多態(tài)性較高。圖2為引物UBC857擴增結果。

圖1　各地麥冬總DNA電泳圖

圖2　UBC857對各地麥冬DNA的擴增圖譜

引物名稱引物序列多態(tài)性條帶數(shù)總條帶數(shù)多態(tài)性比率(%)UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCG81172.72UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT91275UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC101283.33UBC836AGAGAGAGAGAGAGAGYA91464.28UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT91181.82UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG101190.91UBC843CTCTCTCTCTCTCTCTRA81172.72UBC855ACACACACACACACACYT6966.67UBC857ACACACACACACACACYG121392.31UBC859TGTGTGTGTGTGTGTGRC81172.72總計8911577.39平均8.911.577.39

2.3不同產(chǎn)地麥冬的親緣關系分析

利用ISSR-PCR擴增得到的115條帶在NTSYS2.1軟件下計算遺傳相似系數(shù)并推算遺傳相似矩陣。若兩種樣品遺傳相似系數(shù)越接近1，則表明兩者親緣關系越大；反之越小。實驗結果表明，不同產(chǎn)地的麥冬遺傳相似系數(shù)在0.531至0.859之間。其中，慈溪八塘地區(qū)與慈溪九塘地區(qū)樣本的遺傳相似系數(shù)最大，為0.859，即說明這兩地的麥冬親緣關系最近，遺傳差異最小；而湖北襄陽和四川成都兩地的樣品的遺傳相似系數(shù)最小，為0.531。表明這兩地產(chǎn)的麥冬具有較遠的親緣關系，遺傳差異最大。

表4　不同產(chǎn)地麥冬的遺傳相似矩陣

2.4不同產(chǎn)地麥冬的聚類分析

根據(jù)遺傳相似矩陣，利用UPGMA法進行聚類分析。實驗結果表明，當遺傳相似系數(shù)在0.61時，6個地域的麥冬分為2類。第一類為四川、遵義2個地區(qū)的麥冬品種。這2個品種在形態(tài)結構上極為相似，即葉片窄而短，顏色墨綠；第二類為其余兩地的4種麥冬品種。相對于之前的2者，在形態(tài)結構上可以明顯看出，最大的區(qū)別在于后4種麥冬葉片較長，且在顏色上更加豐富，呈現(xiàn)出墨綠、翠綠兩種顏色。

遺傳相似系數(shù)在0.86時，慈溪的2個居群，湖北的2個居群及四川和貴州的2個居群各自聚合在一起，充分體現(xiàn)了地理區(qū)域和環(huán)境對麥冬的影響很大。實驗結果表明麥冬種植區(qū)域越近的麥冬居群，其親緣關系越近。從形態(tài)學上分析，這兩者的形態(tài)結構幾乎一樣，憑肉眼無法分別。實驗證明ISSR分子標記對不同地域的麥冬進行親緣關系分析是可行的。

圖3　不同地區(qū)麥冬的UPGMA聚類圖

3　討　論

由于不同產(chǎn)地的麥冬的形態(tài)特征受到外界環(huán)境條件的影響，很難從形態(tài)結構上將不同產(chǎn)地的麥冬完全區(qū)別開來。而利用分子標記技術，從基因水平上對不同產(chǎn)地的麥冬進行遺傳差異和它們之間的親緣關系分析，就能夠得到更為可靠和有效的結論。陳瑞鳳[6]等利用18條引物對47種短葶山麥冬品種進行遺傳多樣性分析。實驗證明，其多態(tài)性比率為63.4%。GS變化值為0.64至0.98之間。其與本實驗選擇相同的引物為UBC834、UBC835、UBC836、UBC840、UBC843、UBC859；葉桂英[7]等利用ISSR分子標記，對兩種常用的麥冬栽培品種進行聚類分析。實驗結果表明，2種麥冬的GS值為0.818 2，證明兩者具有較高的同源性，與其形態(tài)結構相符。其與本實驗選擇相同的引物為UBC834、UBC835、UBC836、UBC840。此外，何天友[8]、王小剛[9]等也對麥冬ISSR進行過深入研究，指出ISSR分子標記技術能夠很好地區(qū)分不同產(chǎn)地相同物種之間的親緣關系。針對麥冬而言，大量實驗證明其不同品種基因組中含有較多的UBC857引物序列的保守區(qū)，故利用UBC857能更好地對麥冬基因組DNA進行擴增。

麥冬栽培歷史悠久，品種豐富。在長期的自然雜交或人工種植的背景下，又存在普遍的種質資源交流，以至于麥冬成為當今國內許多省份都有分布的廣布種[10]。參試的慈溪八塘和慈溪九塘地區(qū)的麥冬都隸屬于浙麥冬，遺傳背景較為相似，故兩者的親緣關系也比較近(GS=0.86)。而貴州遵義和四川成都所產(chǎn)的麥冬隸屬于川麥冬，從形態(tài)特征而言就與浙麥冬存在差異，故這兩者之間的遺傳相似系數(shù)較小(GS=0.61)。此結論與兩種麥冬生長省份的地理位置相符。而湖北兩地所產(chǎn)的麥冬品種從遺傳圖譜上分析與慈溪麥冬的親緣性更高。故可推斷湖北麥冬與浙麥冬有可能是同一品種下由于長期生殖隔離而產(chǎn)生的不同亞種。

麥冬葉色鮮綠，根系發(fā)達，喜光、耐旱，是全國諸多城市公園、街道和其它各種建筑必不可少的優(yōu)良建植材料。其地下塊根自古即被用作一味中藥治療肺燥、干咳等疾病。不同品系的麥冬在形態(tài)結構和地下塊根藥效程度上存在一定差異。保證品種的純度是麥冬不同品種進行營養(yǎng)繁殖和人類對其進行利用的首要問題。目前大多數(shù)的品種鑒定方法是根據(jù)其形態(tài)結構進行鑒定。此方法針對地域跨度較大，形態(tài)差異較明顯的麥冬品種而言較為有效，但是針對本身難以以肉眼區(qū)分的品種而言則效果不好。且外部表現(xiàn)型時常受到外界環(huán)境的影響，故此方法存在一定的局限性。利用ISSR分子標記法，能夠更好地將各地品種進行聚類，從DNA層面對麥冬進行分析，克服了前一方法的缺點[11]。實驗證明，利用ISSR分子標記得到的結果與根據(jù)形態(tài)結構觀察獲得的結果是一致的，且ISSR可以將肉眼無法分別的慈溪八塘和慈溪九塘地區(qū)的麥冬品種區(qū)分，說明利用ISSR分子標記技術能更好、更精確的處理不同品系之間的親緣關系問題。ISSR分子標記的深入研究，也為我國新品種開發(fā)和品種保護提供技術支持。

[1]趙訓傳, 許文東, 陳建剛. 麥冬栽培技術[M]. 北京：中國農業(yè)科學技術出版社, 2002.

[2]陳莉華, 李三艷, 張燁, 等. 麥冬葉中總黃酮的抗油脂氧化研究[J]. 中國糧油學報, 2013,28(3): 70-74.

[3]張旻, 劉曉萌, 宋捷, 等. 麥冬水浸提液對大鼠胚胎/胎兒發(fā)育毒性研究[J]. 中國中藥雜志, 2010,35(17): 2334-2337.

[4]尤海濤, 李松, 陳菁瑛. 短葶山麥冬主要數(shù)量性狀變異及因子分析[J]. 福建農業(yè)學報, 2008, 23(1):53-57.

[5]王冠明, 韓烈保, 馬秀杰. 麥冬基因組 DNA 提取方法研究[J]. 生物技術通報, 2010: 100-106.

[6]陳瑞鳳, 張君毅. 短葶山麥冬遺傳多樣性的ISSR標記研究[J]. 福建農業(yè)學報, 2010, 25(3):245-250.

[7]葉桂英, 楊美全, 梁國魯, 等. 兩種常用麥冬栽培品種的ISSR分子鑒定[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2007, 3(1) :48-50.

[8]何天友. 短葶山麥冬的遺傳多樣性分析及ISSR指紋圖譜構建[D]. 福州：福建農林大學, 2011.

[9]王小剛. 湖北麥冬種植優(yōu)化和遺傳多樣性研究[D]. 武漢：華中科技大學, 2011.

[10]國家藥典委員會. 中國藥典[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2005.

[11]肖寒, 楊進. 分子生物學技術在麥冬研究中的應用[J]. 中醫(yī)藥導報, 2010，16(11): 120-122.

Genetic Diversity Analysis ofOphiopogonjaponicusby Using ISSR

Hu Zhongyi1, Wu Fan2, Xu Bingbing2, Zhang Jing2, Dai Zhihui2, Ni Sui2*

(1.Ningbo City College of Vocational Technology, Ningbo 315502,China; 2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This research focused on the genetic diversity analysis ofOphiopogonjaponicusincluding six populations, which come from five areas with the way of ISSR markers. Ten primers with clear bands and perfect repeatability are used to amplify DNA ofOphiopogonjaponicus. One hundred and fifteen bands were amplified, including eighty-nine polymorphic bands. The percentage of the polymorphic bands was 77.39%. Samples from six populations can be classified into two groups when the genetic similarity was 0.61. The average value of genetic similarity was 0.643, and it indicates there are very close genetic relationship between different populations, and the regions closer, the more genetic relationship intimate. The research of ISSR markers technology would be helpful for the genetic relationship analysis of the species from different area.

Ophiopogonjaponicus；ISSR-PCR；genetic relationship；genetic diversity

2014-11-12

浙江寧波農業(yè)和社會發(fā)展科技計劃項目(CN2014015)。

胡仲義(1967—)，男，副教授，主要研究方向：植物基礎。E-mail:fhhzy@163.com

*通訊作者：倪穗(1965—)，女，教授，主要研究方向:植物生物學。E-mail:niusui@nbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.006

TS255.6

A

1006-9690(2015)03-0023-04