常二梅 劉建鋒 黃躍寧 李紅麗 單冰燕 江澤平 趙秀蓮*

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3. 北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083；4. 邯鄲市永年區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 056011；5. 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091）

岷江柏（）為國家二級(jí)保護(hù)植物，主要分布在岷江流域、大渡河流域和白龍江流域，是特有的水土保持和先鋒造林樹種之一，具有很高的生態(tài)和研究?jī)r(jià)值。前期的研究表明野生岷江柏具有較高的遺傳多樣性，受人為干擾等因素造成野生居群的遺傳多樣性水平逐漸降低。四川大渡河中上游地區(qū)的岷江柏?cái)?shù)量約占野生岷江柏?cái)?shù)量的90%。近年，由于四川大渡河水電站的開發(fā)，造成兩岸的野生岷江柏直接被淹沒，岷江柏野生種群面積日益縮小，而野生天然林的遺傳多樣性、穩(wěn)定性高于人工林。因此，保護(hù)野生岷江柏種質(zhì)資源勢(shì)在必行。

大量研究表明遷地保護(hù)是有效保護(hù)野生物種居群延續(xù)的有效方法。遷地保護(hù)后的居群遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及居群間基因流等是遷地保護(hù)有效性的指標(biāo)。對(duì)瀕危的野生物種如黃梅秤錘樹（）、金花茶（）的遷地保護(hù)居群和其野生居群進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)狀況對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)遷地保護(hù)能有效地保存這些植物的種質(zhì)資源，但是仍存在遷地保護(hù)居群較小的問題。而狹葉坡 壘（）、廣 西 火 桐（）、南方紅豆杉（var.）遷地保護(hù)居群的遺傳多樣性較低，這可能是遷地保護(hù)中收集種子的范圍小，沒有涵蓋整個(gè)居群。因此，對(duì)野生居群和遷地保護(hù)居群的遺傳多樣性評(píng)價(jià)對(duì)于瀕危植物居群保育具有重要意義。

將物種從野生狀態(tài)下移栽到某一地方后其遺傳多樣性可能會(huì)發(fā)生變化，GBS 測(cè)序技術(shù)能有效地對(duì)種質(zhì)資源居群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行研究，如利用InDel 和SNP 位點(diǎn)分析寬皮柑橘（）、密花石斛（）的居群遺傳和進(jìn)化。岷江柏遷地保護(hù)的地理位置與原來野生居群的地理位置不同，海拔、氣溫及濕度等生長(zhǎng)環(huán)境差異較大。而對(duì)于遷地保護(hù)后的岷江柏居群和野生居群遺傳多樣性、居群結(jié)構(gòu)等諸多方面評(píng)價(jià)還缺乏較為系統(tǒng)的研究。因此，本文利用GBS（Genotyping-by-Sequencing）高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息分析技術(shù)，通過對(duì)野生居群和遷地保護(hù)居群分別進(jìn)行遺傳多樣性分析對(duì)比，探索這兩類居群在居群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等方面的關(guān)系和差異。經(jīng)過對(duì)岷江柏野生居群分布情況進(jìn)行全面清查，為岷江柏野生居群的遷地保護(hù)提供技術(shù)保障和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年開始的四川大渡河上游長(zhǎng)河壩電站建設(shè)直接影響野生岷江柏的生存環(huán)境及物種保護(hù)，2019年8月對(duì)4個(gè)地點(diǎn)的岷江柏居群進(jìn)行采樣（具體分布地點(diǎn)見表1）。選取當(dāng)卡土料場(chǎng)移栽的不同高度（＜1.0 m、1.0～1.5 m、1.5～2.0 m、2.0～2.5 m、2.5～3.0 m）的移栽苗18 株、當(dāng)卡土料場(chǎng)人工播種苗4株、松崗鎮(zhèn)野生苗4株，熱足電站野生苗3株，白灣隧道野生苗4 株。采集以上33 株的當(dāng)年生葉片放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試的岷江柏居群概況Table 1 The status of populations of C.chengiana

1.2 試驗(yàn)方法

利用CTAB 法提取岷江柏葉片的DNA，用OD值和質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量和濃度。質(zhì)量合格的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。建立文庫并經(jīng)過純化、庫檢，Hiseq X10 PE150 上機(jī)測(cè)序。通過測(cè)序質(zhì)量評(píng)估過濾后得到測(cè)序原始數(shù)據(jù)。使用聚類軟件stacks（1.43）對(duì)合格的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行reads 聚類，設(shè)置參數(shù)為-m6-M 6-N0-i1-H，得到tags。再對(duì)tags進(jìn)行overlap處理，對(duì)于沒有overlap的tags用N進(jìn)行鏈接，最后用腳本制作成大小一致的假基因組進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)于鑒定到的SNP 和InDel 用Annovar 軟件進(jìn)行注釋。根據(jù)得到的SNP 信息，計(jì)算樣品間距離，對(duì)樣品進(jìn)行居群主成分分析（PCA 分析）、聚類分析、構(gòu)建分子進(jìn)化樹，從而推斷出居群間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

利用POPGENE version 1.32 軟件分別計(jì)算觀察樣本的雜合度（）、期望雜合度（）、基因多樣性指數(shù)（）、多態(tài)信息含量（）、Shannon 信息指數(shù)（）、固定指數(shù)F（Fixed index）、核苷酸多樣性（）、遺傳分化指數(shù)（）及基因流（）。使用treebest 軟件，通過鄰接法（neighbor-joining methods）構(gòu)建進(jìn)化樹。使用Admixture軟件進(jìn)行居群結(jié)構(gòu)分析。居群結(jié)構(gòu)分析圖注：以每種顏色代表一個(gè)居群，用每個(gè)豎線塊代表一個(gè)樣本；每個(gè)豎線塊的寬度代表在祖先居群中的比例。居群結(jié)構(gòu)交叉驗(yàn)證分析圖注，找到最合適的值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量

將18 株岷江柏移栽個(gè)體、4 株播種個(gè)體及11株野生岷江柏個(gè)體進(jìn)行GBS 測(cè)序，共獲得Clean Data 118 321 514 728 bp，Q平均值為96.81%，Q平均值（測(cè)序堿基質(zhì)量值，即測(cè)序時(shí)錯(cuò)誤識(shí)別的概率是0.1%、正確率為99.9%的堿基比例）為91.23%，GC 含量為35.22%，岷江柏居群過濾后的SNP 位點(diǎn)有1 259 610個(gè)。

2.2 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群的遺傳聚類

根據(jù)岷江柏居群測(cè)序過濾后的1 259 610 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析，構(gòu)建遷地保護(hù)居群和野生居群個(gè)體的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖1），從圖1 的可以看出，共分5 個(gè)分支，第1 分支包括高度為2.0～2.5 m、2.5～3.0 m 的當(dāng)卡土料場(chǎng)移栽地的岷江柏個(gè)體；第2 分支包括高度為2.5～3.0 m 的當(dāng)卡土料場(chǎng)移栽地岷江柏個(gè)體、苗圃地的播種種植的岷江柏個(gè)體、熱足電站野生岷江柏個(gè)體；第3 分支包括高度為1.0～1.5 m、1.5～2.0 m 的卡土料場(chǎng)移栽的岷江柏個(gè)體，第4 分支包括高度小于1.0 m 當(dāng)卡土料場(chǎng)移栽的岷江柏個(gè)體、苗圃地播種種植的岷江柏個(gè)體、白灣隧道野生的岷江柏個(gè)體聚在一起；尤其是第5分支包括當(dāng)卡土料場(chǎng)移栽種植的岷江柏個(gè)體、熱足電站野生的岷江柏個(gè)體、白灣隧道野生的岷江柏個(gè)體、松崗鎮(zhèn)野生的岷江柏個(gè)體，表明移栽的岷江柏個(gè)體和野生的岷江柏個(gè)體之間有較近的親緣關(guān)系。

圖1 泯江柏個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Individual phylogenetic tree of C.chengiana

2.3 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群的主成分分析

居群主成分分析能反應(yīng)出岷江柏個(gè)體之間的親緣關(guān)系（見圖2）。PC1、PC2 的貢獻(xiàn)率分別為3.77%和3.65%，累計(jì)貢獻(xiàn)7.42%。PC2、PC3 的貢獻(xiàn)率分別為3.65% 和3.46%，累計(jì)貢獻(xiàn)7.11%。PC1、PC2、PC3 共同解釋了10.88%的總變異。貢獻(xiàn)率低說明33個(gè)岷江柏個(gè)體沒有被分開。不同地點(diǎn)間的個(gè)體在PCA 圖上的分布分散，但沒有明顯的分群現(xiàn)象，這也表明所有個(gè)體之間親緣關(guān)系較近。與岷江柏個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果相似，表明移栽的岷江柏個(gè)體沒有產(chǎn)生遺傳變異，表明這些岷江柏個(gè)體可能是來自同一個(gè)居群。

圖2 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群的主成分分析Fig.2 The analysis of principal componentsof wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.4 岷江柏遷地保護(hù)和野生的居群結(jié)構(gòu)

通過Structure 軟件基于開發(fā)出的1 259 610個(gè)SNP 位點(diǎn)，將遷地保護(hù)居群和野生居群的33 個(gè)岷江柏個(gè)體進(jìn)行交叉驗(yàn)證聚類。從圖3 可以看出交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)為1。值設(shè)置為1～9 進(jìn)行聚類（見圖4），聚類情況及各個(gè)值對(duì)應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率，值等于2～5、8～9 時(shí)，DK-a4 和RJ-d1 聚在一起，說明這兩個(gè)個(gè)體親緣關(guān)系較近，移栽居群和野生居群的遺傳多樣性差異不大。結(jié)果表明33 個(gè)岷江柏個(gè)體為一個(gè)居群，進(jìn)一步說明聚類的準(zhǔn)確性，可以判斷岷江柏移栽后遺傳多樣性沒有發(fā)生改變。

圖3 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群的不同K 值所對(duì)應(yīng)的的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率Fig.3 The admixture validation error rate corresponding to the different K values of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

圖4 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群的Structure聚類分析Fig.4 Structure clustering of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.5 岷江柏遺傳多樣性

當(dāng)卡村的遷地保護(hù)居群、松崗鎮(zhèn)野生居群、熱足電站野生居群和白灣隧道野生居群4 個(gè)居群的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示觀測(cè)雜合度（）、期望雜合度（）、基因多樣性指數(shù)（）及Shannon 信息指數(shù)（）的平均值分別為0.243 7、0.303 1、0.308 6、0.470 7（見表2）。當(dāng)卡土料場(chǎng)的遷地保護(hù)居群的、、的值分別為0.300 3、0.308 9、0.464 9，均高于其他居群，說明遷地保護(hù)的岷江柏居群遺傳多樣性最高。多數(shù)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度均小于期望雜合度，這可能與居群內(nèi)存在不同程度的近交、所取樣本小等有關(guān)。值在-0.031 9～0.187 0，值在0.272 2～0.308 9，4個(gè)岷江柏居群的F_index值進(jìn)行比較，當(dāng)卡土料場(chǎng)的遷地保護(hù)居群為0.246 5，位列第一，松崗鎮(zhèn)野生居群最低，為0.178 0。這個(gè)分析結(jié)果說明本研究中不同地理來源的岷江柏居群基因的多樣性水平較高，當(dāng)卡土料場(chǎng)的遷地保護(hù)居群的遺傳多樣性水平最高，熱足電站野生居群、白灣隧道野生居群遺傳多樣性水平次之，而松崗鎮(zhèn)野生居群最低。

表2 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群間的遺傳多樣性分析Table 2 Analysis of genetic diversity of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

值是表征居群間的遺傳分化程度（見表3），對(duì)比后發(fā)現(xiàn)BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值在0～0.05，說明岷江柏居群間的遺傳分化很弱；DK_vs_SA 和BW_vs_SA 在 的值 在0.05～0.15，說明岷江柏居群間遺傳分化屬于中等水平；在5 個(gè)成對(duì)居群的值中，沒有成對(duì)居群的值大于0.25。由此可知，4 個(gè)岷江柏居群間幾乎不存在著明顯的遺傳分化。DK_vs_SA 和BW_vs_SA 的值分別為3.541 3 和2.497 0，表現(xiàn)出較高的基因交流水平。BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值分別為6.805 6、5.173 3 和10.815 9，表現(xiàn)為高度的基因交流水平，說明當(dāng)卡土料場(chǎng)的遷地保護(hù)居群和熱足電站野生居群的遺傳距離最近，并且可以看出岷江柏居群間的遺傳分化程度較小。

表3 岷江柏遷地保護(hù)和野生居群間的遺傳分化系數(shù)和基因流參數(shù)Table 3 Genetic diversity and genetic differentiation parameters of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

對(duì)不同岷江柏居群間遺傳距離的研究有助于對(duì)其遺傳多樣性的研究，也可以用來表述岷江柏居群間遺傳結(jié)構(gòu)差異。對(duì)于不同居群之間的居群遺傳多樣性可通過Pairwise統(tǒng)計(jì)來進(jìn)行研究。DK_vs_SA和BW_vs_SA的值分別為0.151和0.152，說明遺傳有顯著差異，表明其遺傳距離與其他居群也較遠(yuǎn)。從表4可看出，遷地保護(hù)的居群與熱足電站和白灣隧道野生岷江柏居群Fst值均沒有表現(xiàn)出顯著性差異，這3個(gè)居群的遺傳距離較近。

表4 各居群之間差異位點(diǎn)Pairwise Fst統(tǒng)計(jì)Table 4 Pairwise Fst summary statistics for all variant positions between each population

3 討論

以往研究中，GBS 技術(shù)利用開發(fā)的SNP 標(biāo)記應(yīng)用于小麥（）、砂生槐（）、沉 水 樟（）、牛樟（）等許多植物的居群遺傳分析。本研究運(yùn)用GBS 技術(shù)鑒定的SNP 位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)大部分群聚在一起的遷地保護(hù)岷江柏居群和野生岷江柏居群，沒有明顯的分群現(xiàn)象。這與廣西火桐植物園遷地保護(hù)居群和部分野生居群聚在一起的結(jié)果相似，說明遷地保護(hù)岷江柏居群和野生居群的遺傳多樣性差異不大。

保存野生岷江柏居群的遺傳多樣性是遷地保護(hù)成功的關(guān)鍵。本文中遷地保護(hù)的岷江柏居群的=0.300 3，=0.464 9，這高于四川省和甘肅省的8 個(gè)自然居群使用ISSR 方法測(cè)定的=0.226，=0.347 和AFLP 方 法 測(cè) 定 的=0.113，=0.171，這些岷江柏居群的＜，可能是岷江柏居群的近交嚴(yán)重造成的。但是在以往的研究中大部分遷地保護(hù)的居群的遺傳多樣性水平均低于野生居群，如：金花茶居群、狹葉坡壘，這可能是遷地保存的種子繁殖苗采取了同一棵母株的種子，從而降低了單位引物多態(tài)位點(diǎn)比率。岷江柏居群遷地保護(hù)居群遺傳多樣總體水平略高于野生居群，主要可能有兩個(gè)原因：一是移栽能較好的保存野生居群遺傳多樣性；二是在遷地保存的移栽苗來自多個(gè)自然居群，從而增加了遺傳多樣性水平。

岷江柏的4 個(gè)居群中只有BW_vs_SA 的遺傳分化程度中等。另外其他居群的＜0.05，＞4，表明這些居群間沒有遺傳分化，居群間的基因交流頻繁。四川?。?0.475，=0.553）和甘肅?。?0.4791，=0.5436）采集的8 個(gè)自然居群出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，居群間的基因流動(dòng)頻率較低。在遷地保護(hù)狹葉坡壘、廣西火桐、南方紅豆杉居群時(shí)，也存在一定程度的遺傳分化，基因流較低，這可能是自然居群中的野外幼苗成活率低，從而限制了居群間的基因交流，增加了居群間的遺傳分化。本研究的岷江柏遷地保護(hù)居群和野生居群可能范圍較近，因此遺傳上居群間沒有出現(xiàn)顯著差異。因此，在遷地保護(hù)過程中盡可能擴(kuò)大遷地保護(hù)居群的規(guī)模，增大遷地保護(hù)的個(gè)體數(shù)量，以增加其遺傳多樣性水平，同時(shí)開展長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和適應(yīng)性評(píng)價(jià)，提高遷地保護(hù)效率。

4 結(jié)論

利用鑒定到的1 259 610個(gè)SNP位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)大部分遷地保護(hù)的移栽岷江柏居群和野生岷江柏居群聚在一起，沒有明顯的分群現(xiàn)象。遷地保護(hù)的移栽岷江柏居群遺傳多樣性較高，并且居群間沒有遺傳分化，居群間的基因交流頻繁。因此，為更好地保護(hù)岷江柏居群遺傳水平，遷地保護(hù)過程中應(yīng)盡可能多地從尚未進(jìn)行過收集的各自然居群中采集繁殖材料，為其他野生植物的遷地保護(hù)評(píng)價(jià)提供參考。