魏丹紅 徐紅

1.寧?？h婦幼保健院 浙江，寧海 315600 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，主要分布于我國臺(tái)灣、海南、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州、云南、四川等亞熱帶地區(qū)[1]。金釵石斛是中藥石斛的常用品種之一，為歷版《中國藥典》的石斛收載品種，具有益胃生津、滋陰清熱、強(qiáng)陰益精、久服厚腸胃等功效[2-3]。近三十年來由于過度采挖利用和人為生境破壞，野生金釵石斛資源遭到嚴(yán)重破壞，野生居群規(guī)模銳減。為滿足藥用需求，近幾年在金釵石斛的分布地貴州、四川、重慶等地已經(jīng)開始規(guī)模性的金釵石斛人工栽培，一定程度上緩解了資源緊缺的狀況。近來有學(xué)者用序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymor-phism，SRAP）分子標(biāo)記[4]和簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter simple sequence repeat，ISSR）[5]技術(shù)研究金釵石斛的遺傳多樣性，然而研究取樣僅局限于貴州地區(qū)和秦巴地區(qū)，產(chǎn)地缺乏代表性。ISSR技術(shù)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)真核生物中廣泛存在1～6個(gè)堿基的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）的特點(diǎn)，對(duì)SSR之間的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，檢測SSR序列間的DNA序列差異。與SRAP分子標(biāo)記、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）比較，該技術(shù)檢測的遺傳多態(tài)性豐富，具有簡單快速、重復(fù)性及穩(wěn)定性高等優(yōu)勢，是研究藥用植物遺傳多樣性的常用分子標(biāo)記[6-7]。因此，本研究擬運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國主要產(chǎn)區(qū)的21個(gè)居群的152個(gè)金釵石斛樣本進(jìn)行分子水平的遺傳多樣性研究，探明其遺傳多樣性現(xiàn)狀，為金釵石斛種質(zhì)資源的保護(hù)和新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 用于遺傳多樣性分析的金釵石斛材料包括3個(gè)野生居群和18個(gè)栽培居群，共21個(gè)居群的152個(gè)個(gè)體樣本，采集于2006年4月至7月。除浙江居群外，其他金釵石斛居群樣本都留有標(biāo)本，現(xiàn)存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，各樣本均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所徐紅博士鑒定原植物學(xué)名。金釵石斛居群樣本信息見表1。

表1 金釵石斛居群樣本信息Tab.1 Samples of population from D.nobile

1.2 主要試劑 Plant DNA Mini Kit試劑盒購于上海華舜生物工程有限公司（批號(hào)：HS017G03）；溴代十六烷基三乙胺（cetyltrimenthyl ammonium bromide，CTAB）購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司（批號(hào)：F20070220）；分析純乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、GeneRulerTMDNA Ladder Mix和GeneRulerTM1kb DNA Ladder均購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：F20070316、12403651、13256312）。

1.3 主要儀器 PTC-200型PCR儀購于美國MJ Research公司；Image Master VDS凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀系統(tǒng)裝置購于北京六一儀器廠；Nucleic Acid and Protein Analyzer、AvantiTM30離心機(jī)均為美國Beckman公司產(chǎn)品。

1.4 DNA提取 本研究采用改良的CTAB法提取DNA[8-9]，所有植株均采集上部嫩枝嫩葉進(jìn)行提取，提取物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ISSR引物及其產(chǎn)物檢測 從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物（University of British Columbia，Set No.801～900）和文獻(xiàn)[10]報(bào)道的10條引物中篩選出多態(tài)性較高的、適合金釵石斛ISSR擴(kuò)增的10條引物UBC811、UBC834、UBC841、UBC842、UBC873、UBC880、UBC881、No.5（（AG）8AA）、No.7（（AC）8GA）和No.9（（AG）8CC），作為選定的正式引物用于金釵石斛遺傳多樣性研究，以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 反應(yīng)體系共10μL：DNA （約10ng）1.0μL，25mmol·L-1的MgCl20.80μL，10mmol·L-1的dNTP mix 0.20μL，10μmol·L-1引物1.0μL，5U·μL-1Taq聚合酶0.12μL。 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min；94°C 45s，51°C 45s，72°C 2min，共38個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min[9]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用POPGENE1.32軟件計(jì)算居群內(nèi)及居群間的等位基因數(shù)（number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon's information index，Im）與多態(tài)位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）、居群總遺傳變異（total genetic diversity for species，Ht）、居群內(nèi)的遺傳變異 （the mean heterozygosity within population，Hs）、居群間的遺傳變異（the mean heterozygosity among population，Dst）、 居群間的遺傳分化系數(shù)（coefficient of gene differentiation，Gst）、 基 因 流 （gene flow，Nm）和居群間Nei無偏遺傳距離[11-12]。其中Dst=Ht-Hs。用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算樣品間的Jaccard遺傳相似性系數(shù)（1908），用SHAN程序?qū)?jīng)Lynch-Milligan校正過的Nei無偏遺傳距離構(gòu)建居群間非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair group with arithmetic average，UPGMA）聚類圖，并利用UPGMA聚類對(duì)全部居群樣品之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，采用AMOVA 1.55軟件進(jìn)行分子方差分析，計(jì)算居群內(nèi)、居群間和地區(qū)之間的變異方差分布[12-15]。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性和遺傳多樣性 金釵石斛共152個(gè)樣本，運(yùn)用篩選出的10個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出292條重復(fù)性高、清晰的條帶，擴(kuò)增片段的長度從100～10 000bp，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出29.2條條帶，多態(tài)性條帶為292條，有效條帶百分率為100%。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性因引物而異，每個(gè)引物在每個(gè)居群中擴(kuò)增出的有效條帶數(shù)為6～29條。用ISSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以清晰、有效地分辨出不同居群個(gè)體的基因型，居群內(nèi)的個(gè)體間也有一定程度基因型的分化，即每個(gè)個(gè)體都具有獨(dú)立的基因型，152個(gè)個(gè)體共計(jì)152個(gè)基因型。21個(gè)居群中，以云南西雙版納勐海居群（居群編碼18）和景洪大渡崗居群（居群編碼17）的多樣性最豐富，PPB分別為47.95%和46.58%，總條帶數(shù)也最多，分別為161和170條；浙江樂清龍西居群（居群編碼14）的多樣性最低，PPB為9.93%，擴(kuò)增的總條帶數(shù)最少，為76條；其他居群介于二者之間。見表2。PPB數(shù)據(jù)表明，ISSR-PCR能夠在不同產(chǎn)地的金釵石斛居群中檢測出豐富的遺傳多態(tài)性，引物UBC811對(duì)金釵石斛不同居群樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增圖見圖1。

圖1 引物UBC811對(duì)金釵石斛不同居群樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增條帶Fig.1 The ISSR-PCR pattern of D.nobile from different populations using primer UBC811

表2 不同ISSR引物在不同居群中擴(kuò)增出的條帶數(shù)Tab.2 Number of bands per prime on different populations

2.2 居群遺傳多樣性分析 運(yùn)用POPGENE1.32軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，得到的遺傳多樣性參數(shù)見表3?？芍疴O石斛在物種水平的多態(tài)位點(diǎn)百分率是100%，Na為2.0000，Ne為1.3863，He為0.2398，Im為0.3783。 各居群PPB為9.93%～47.95%，Im為0.0601～0.2519，基因多樣性與Im結(jié)果基本相符。

表3 金釵石斛居群、物種水平遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)Tab.3 Summary of genetic diversity estimation at the population and the species level for D.nobile

將來自同一個(gè)采集地區(qū)的所有個(gè)體匯總成一個(gè)居群，根據(jù)Na和PPB，各居群遺傳多樣性大小順序排列為：云南＞重慶＞四川＞海南＞廣西＞貴州＞浙江。根據(jù)遺傳水平的算術(shù)平均值，依據(jù)Na和PPB，各居群遺傳變異由高到低依次為：云南＞重慶＞四川＞海南＞廣西＞貴州＞浙江；依據(jù)Ne和He，各居群遺傳變異由高到低依次為：云南＞重慶＞貴州＞四川＞海南＞廣西＞浙江；依據(jù)Im，各居群遺傳變異由高到低依次為：云南＞重慶＞四川＞貴州＞海南＞廣西＞浙江。按地區(qū)進(jìn)行比較，所有遺傳多樣性指數(shù)均表明遺傳水平最高的是云南居群，最低的是浙江居群。地區(qū)間金釵石斛遺傳多樣性比較見表4。

從表4可見，Na與PPB對(duì)21個(gè)居群金釵石斛遺傳多樣性的評(píng)價(jià)結(jié)果呈現(xiàn)一致的趨勢，各居群遺傳變異由高向低的居群為18＞17＞10＞……＞21＞14，平均為28.59%；根據(jù)Im，各居群遺傳變異由高向低的居群是18＞17＞10＞16＞……＞21＞14，平均為0.1482。 18個(gè)栽培居群的Im平均值為0.1469，略低于3個(gè)野生居群的平均值（0.1556）。SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)Im的統(tǒng)計(jì)分析也表明，栽培居群與野生居群的Im差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明金釵石斛在栽培過程中遺傳多樣性基本上沒有喪失。所有居群中，云南西雙版納勐海居群（居群編碼18）的遺傳變異水平最高，浙江樂清龍西居群（居群編碼14）的遺傳變異水平最低。以上數(shù)據(jù)說明金釵石斛的21個(gè)居群出現(xiàn)了不同程度的遺傳變異，具有一定的遺傳多樣性。

表4 金釵石斛地區(qū)水平遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)Tab.4 Summary of genetic diversity estimation at the region level for D.nobile

2.3 居群的遺傳結(jié)構(gòu) 本研究涉及的21個(gè)金釵石斛居群按照采集地區(qū)的不同可分為7個(gè)地區(qū)，即重慶（居群編碼1～4）、海南（居群編碼5～8）、四川（居群編碼9～13）、浙江（居群編碼14）、貴州（居群編碼15～16）、云南（居群編碼17～19）和廣西（居群編碼20～21）。 為了更加清楚地了解金釵石斛居群遺傳變異的空間結(jié)構(gòu)，采用AMOVA 1.55軟件對(duì)21個(gè)居群進(jìn)行了幾種不同等級(jí)的處理：（1）7個(gè)地區(qū)之間和地區(qū)之內(nèi)；（2）21個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（3）四川5個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（4）重慶4個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（5）海南4個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（6）貴州2個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（7）云南3個(gè)居群之間和居群之內(nèi)；（8）廣西2個(gè)居群之間和居群之內(nèi)。AMOVA分析結(jié)果表明，物種水平、居群水平、地區(qū)內(nèi)居群水平和地區(qū)間居群水平均在兩個(gè)不同層次上出現(xiàn)分化。不劃分地區(qū)則55.58%的遺傳變異存在于21個(gè)居群間，44.42%存在于居群內(nèi)。劃分地區(qū)，則四川、重慶、海南和貴州的遺傳變異較大部分存在居群內(nèi)，云南和廣西的較大部分存在居群間，其中含有3個(gè)野生居群的四川5個(gè)居群間的遺傳變異最小為36.89%，居群內(nèi)的遺傳變異為63.11%；廣西的2個(gè)居群間的遺傳變異最大，為65.81%；重慶4個(gè)居群間的遺傳變異為44.28%，居群內(nèi)的遺傳變異為55.72%；海南4個(gè)居群間的遺傳變異為45.68%，居群內(nèi)的遺傳變異為54.32%。見表5。以21個(gè)居群為一組，Gst為0.5779，表明在總的遺傳變異中有57.79%存在于居群之間，42.21%的遺傳變異存在于居群內(nèi)，總的遺傳變異分析結(jié)果比AMOVA分析（55.58%）略高，但是結(jié)果的趨勢是一致的，即居群間的變異略高于居群內(nèi)。按照采集地區(qū)劃分，廣西2個(gè)居群Gst最高，為0.5303；貴州2個(gè)居群Gst最低，為0.3130；說明地區(qū)間的遺傳變異大于地區(qū)內(nèi)。見表6。

表5 金釵石斛居群的分子方差分析Tab.5 AMOVA analysis for D.nobile from different populations

2.4 居群的Nm格局 根據(jù)POPGENE1.32軟件分析所得的金釵石斛21個(gè)居群的Nm格局顯示，具有2個(gè)以上居群的各地區(qū)居群中，貴州2個(gè)居群的Nm最大，為0.5487；廣西2個(gè)居群的Nm值最小，為0.2214，全部21個(gè)居群的Nm值的平均值為0.1826。見表6。

表6 金釵石斛居群基因分化的居群間的Gst分析Tab.6 Gst of 21 populations of D.nobile by ISSR markers

2.5 居群間的遺傳距離及遺傳一致性 根據(jù)POPGENE1.32軟件計(jì)算出居群間Nei無偏遺傳距離與遺傳一致性，21個(gè)居群間遺傳一致性為0.7149～0.9527，平均0.8506。其中四川的2個(gè)野生居群石棉田灣居群（居群編碼10）與瀘定燕子溝居群（居群編碼11）遺傳距離最小，為0.0485；栽培的云南景洪大渡崗居群（居群編碼17）與栽培的廣西靖西安德居群（居群編碼20）的遺傳距離最大，為0.3356。遺傳一致性正好與遺傳距離相反，遺傳距離最小的兩個(gè)居群，遺傳一致性表現(xiàn)最大，石棉田灣居群（居群編碼10）與瀘定燕子溝居群 （居群編碼11）之間的遺傳一致性最大，為0.9527；大渡崗居群（居群編碼17）與安德居群（居群編碼20）之間的遺傳一致性最小，為0.7149。四川5個(gè)居群的遺傳一致性為0.8860～0.9527，平均為0.9182；重慶4個(gè)居群的遺傳一致性為0.8862～0.9113，平均0.8990；海南4個(gè)居群的遺傳一致性為0.8794～0.8891，平均0.8838。 見表7。

2.6 DNA聚類分析 用NTSYSpc 2.1軟件中的SHAN程序?qū)ei的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類，構(gòu)建基于ISSR標(biāo)記的遺傳聚類圖。見圖2。從圖中可以看出21個(gè)居群聚成3組：云南景洪大渡崗栽培居群（居群17）獨(dú)自為一組；廣西的2個(gè)居群靖西安德馬扒栽培居群（居群20）和樂業(yè)百中栽培居群（居群21）合為一組；第3組主要由5個(gè)四川居群 （居群9～13）、4個(gè)重慶居群（居群1～4）、2個(gè)云南居群（居群18～19）與2個(gè)貴州居群（居群15～16），以及分散在各個(gè)分支的4個(gè)海南居群（居群5～8）組成，其中所有的四川居群與重慶居群各自聚集在一個(gè)大的分支上，貴州的2個(gè)居群聚在一起（居群15～16）。

圖2 基于ISSR分子標(biāo)記的金釵石斛居群間的遺傳聚類圖Fig.2 Dendrogram of D.nobile from different populations based on ISSR analysis

3 討論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記檢測了分布于全國7個(gè)省區(qū)21個(gè)金釵石斛居群的遺傳多樣性，結(jié)果表明金釵石斛的21個(gè)居群出現(xiàn)了不同程度的遺傳變異，具有一定的遺傳多樣性。所有居群中，云南勐海勐宋栽培居群（居群18）表現(xiàn)出最高的遺傳變異水平，表明該栽培群體有助于當(dāng)?shù)卦耘嘟疴O石斛的種質(zhì)資源篩選和新品種選育。浙江樂清栽培居群（居群14）的遺傳變異水平最低，而且明顯低于其他20個(gè)居群，筆者分析這可能與該居群來源不詳、樣本數(shù)較少（2個(gè)樣本）、研究數(shù)據(jù)有限，因而不能夠全面反映居群遺傳變異情況有關(guān)。而ISSR分子標(biāo)記在其他20個(gè)居群中檢測出豐富的遺傳多樣性，說明該標(biāo)記技術(shù)可以有效地應(yīng)用于金釵石斛的遺傳多樣性評(píng)價(jià)研究。

Nm是指基因在居群之內(nèi)和居群之間的運(yùn)動(dòng)，也是影響居群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素之一?；虻南嗷ソ涣骺梢鹁尤簝?nèi)遺傳變異量的增加，減少居群間的分化。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)Nm＜1時(shí)遺傳漂變就成為刻畫種群遺傳結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素，是居群遺傳結(jié)構(gòu)分化的主要原因[16]。全部21個(gè)金釵石斛居群的Nm值為0.1826，說明居群間交流不夠，導(dǎo)致了金釵石斛居群間的遺傳分化，這與遺傳變異較大部分存在于居群間（57.79%）的分析結(jié)果是一致的。

DNA聚類分析表明，在居群水平上遺傳距離聚類與地理分布有一定相關(guān)性，金釵石斛產(chǎn)區(qū)之間有一定的遺傳分化。分布于海南的4個(gè)居群分散在不同的分支上，居群分化明顯，初步分析可能與居群種質(zhì)的來源與栽培的年限有關(guān)，具體有待于進(jìn)一步的深入研究。

一般說來，物種遺傳多樣性越豐富，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越大，進(jìn)化潛力就越大。本文運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)金釵石斛居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明金釵石斛居群遺傳多樣性較高，豐富的遺傳多樣性是金釵石斛在一定范圍內(nèi)生長分布、對(duì)環(huán)境有較好適應(yīng)能力的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，金釵石斛野生居群銳減的主要原因不在于其遺傳變異方面，而是來自人為過度采挖所導(dǎo)致的生境破壞和退化。自然生境的片段化、破碎化的現(xiàn)象越來越明顯，這些將成為金釵石斛居群遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要原因。