陳 欣，王 超，張曉烜，王 帥

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

甘藍(lán)根腫病，是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin）侵染引起的一種世界性土傳病害，該病原菌除侵染甘藍(lán)外，還可侵染其他十字花科蔬菜引起根腫病。受侵染的甘藍(lán)表現(xiàn)為根部組織異常增生、腫大，植株地上部發(fā)育遲緩，不能形成正常的葉球，嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收［1］。由于根腫病為土傳病害，其病菌休眠孢子在無感病寄主的土壤中可存活20年之久，土壤一旦污染，將不再適宜十字花科蔬菜的栽培［2］。國內(nèi)外的研究和實(shí)踐證明，防治該病害的最根本途徑是選育抗病品種，而建立一套穩(wěn)定的人工接種體系是抗病育種的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外對(duì)甘藍(lán)根腫病最佳人工接種體系仍無定論，為此，本研究在參考已報(bào)道的十字花科蔬菜根腫病的各種接種方法和條件的基礎(chǔ)上，對(duì)比了不同接種方法，不同接種濃度以及不同土壤pH 條件對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響，篩選出適合甘藍(lán)根腫病接種的最佳組合，從而建立一套穩(wěn)定的甘藍(lán)根腫病接種體系，并利用此接種體系，對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)甘藍(lán)課題組提供的20份甘藍(lán)材料進(jìn)行了抗性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)基地甘藍(lán)根腫病發(fā)病田塊采集發(fā)病植株腫根和菌土，-20℃冷凍保存。

供試甘藍(lán)材料：高度感病品種‘京豐一號(hào)’［3］；由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院甘藍(lán)課題組提供的20個(gè)自交系：‘PM’、‘PF’、‘P1’、‘P2’、‘P3’、‘P4’、‘R’、‘Q1’、‘Q2’、‘Q3’、‘3-1003’、‘3-1004’、‘3-1005’、‘3-1006’、‘3-1009’、‘3-1012’、‘3-1015’、‘3-1017’、‘3-1020’、‘3-1021’。

1.2 方法

1.2.1 病田土壤含菌量的測(cè)定

為了解根腫菌的致病濃度，從而確定有效的接種濃度，對(duì)發(fā)病田塊土壤中病原菌休眠孢子含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，方法如下：在發(fā)病田塊共確定20個(gè)樣點(diǎn)（按不同品種設(shè)點(diǎn)取樣），由于根腫菌休眠孢子活動(dòng)較為集中，在土層10cm 處含量較多［4］，因此取樣時(shí)在每個(gè)取樣點(diǎn)的病株根部周圍距地表10cm 處取500g土壤，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的休眠孢子［5］，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)休眠孢子濃度，并計(jì)算20個(gè)樣點(diǎn)土壤含菌量的平均值，以此作為后續(xù)試驗(yàn)接種濃度的參考指標(biāo)。

1.2.2 接種液的制備

取出部分冷凍保存的甘藍(lán)腫根，室溫解凍，剪成小塊后稱重，加等量無菌水，用組織搗碎勻漿機(jī)攪成勻漿后4層紗布過濾，4 000r／min 離心15min，棄上清液；用無菌水懸浮沉淀，3 500r／min 離心10 min，棄上清液，重復(fù)此步3次，最后棄上清液，重新用無菌水懸浮沉淀，制成根腫菌休眠孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)休眠孢子懸浮液濃度，并調(diào)至1.6×108個(gè)／mL（參考發(fā)病田塊土壤含菌量的平均值）。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同接種方法對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

蘸根法［6］：將消毒的‘京豐一號(hào)’種子播種在裝有滅菌基質(zhì)（蛭石∶草炭∶滅菌土＝1∶1∶2）的營(yíng)養(yǎng)缽（直徑×高度＝9cm×9cm）中，培養(yǎng)10d后拔出無病蟲幼苗，將其根部洗凈并用吸水紙吸干，然后將根部浸入配制好的1.6×108個(gè)／mL休眠孢子懸浮液中，4h后將幼苗重新移植到營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)，正常管理。

根際土壤注菌法［7］：將消毒后的‘京豐一號(hào)’種子播在裝有滅菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，用移液槍吸取2 mL配制好的1.6×108個(gè)／mL 休眠孢子懸浮液注射于根際基質(zhì)，正常管理。

菌土法［8-9］：將冷凍保存的甘藍(lán)腫根取出，室溫解凍，剪成小塊后稱重，加等量無菌水，用組織搗碎勻漿機(jī)攪成勻漿后，與滅菌基質(zhì)混勻，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的休眠孢子［5］，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)休眠孢子濃度，最終使混勻后的菌土中休眠孢子濃度達(dá)1.6×108個(gè)／g基質(zhì)，在25 ℃黑暗條件下保濕48h，然后在裝有滅菌基質(zhì)的培養(yǎng)缽中挖一圓柱形小洞（直徑30 mm，高35 mm），將混合好的菌土撒入其中，然后將消毒后的‘京豐一號(hào)’種子播入，正常管理。

以上各處理分別接種幼苗30 株，對(duì)照為同苗齡期未做接種處理的‘京豐一號(hào)’植株，3次重復(fù)，在25 ℃條件下培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，6 周后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.4 不同接種濃度對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

采用菌土法接種，稱取一定量的甘藍(lán)腫根，加等量水后，用組織搗碎勻漿機(jī)攪成勻漿后與定量的滅菌基質(zhì)混勻制成6種不同濃度的菌土，各處理濃度為：每克滅菌基質(zhì)中分別拌入0.002、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4g腫根，統(tǒng)計(jì)6種不同濃度的菌土中的病菌孢子含量，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的孢子［5］，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度。分別對(duì)‘京豐一號(hào)’，‘PM’，‘P3’，‘3-1012’進(jìn)行接種，每種供試甘藍(lán)材料的每個(gè)接種濃度重復(fù)3次，每次重復(fù)接種30株，以同苗齡期未做接種處理的‘京豐一號(hào)’植株為對(duì)照，在25 ℃條件下培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，6周后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.5 不同土壤pH 條件對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

采用菌土法接種，選擇1.2.4試驗(yàn)篩選得到的最佳接種濃度（1.6×108個(gè)／g基質(zhì)）配制菌土，用硫酸亞鐵溶液和石灰水分別調(diào)節(jié)菌土pH 至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0等6種不同pH，每個(gè)處理各接種‘京豐一號(hào)’30株，以不經(jīng)處理的菌土作對(duì)照，3次重復(fù)，在25℃條件下培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，6周后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.6 室內(nèi)人工接種法對(duì)供試甘藍(lán)材料進(jìn)行根腫病抗性鑒定

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)甘藍(lán)課題組溫室內(nèi)，采用1.2.2～1.2.5確定的最佳接種體系，對(duì)20份甘藍(lán)材料進(jìn)行接種，每份材料30株，對(duì)照為已知感病品種‘京豐一號(hào)’，3次重復(fù)，培養(yǎng)6周后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

甘藍(lán)根腫病室內(nèi)人工接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］如下：

單株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，根部無任何腫瘤；1級(jí)，主根腫大，其直徑小于2 倍莖基，或須根有小腫瘤；腫大部分直徑在4mm 以下；3級(jí)，主根腫大，其直徑為莖基的2～3倍，腫大部分直徑約4～6mm；5級(jí)，主根腫大，其直徑為莖基的3～4倍，腫大部分直徑約6～8mm；7級(jí)，主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上，腫大部分直徑約8mm 以上。

病情指數(shù)（DI）＝∑（發(fā)病級(jí)代表值×各級(jí)病株數(shù)）×100／（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)發(fā)病代表值）

甘藍(lán)根腫病群體抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［10］如下：

免疫（I）：DI＝0；高抗（HR）：0＜DI≤5；抗?。≧）：5＜DI≤15；中抗（MR）：15＜DI≤30；感?。⊿）：30＜DI≤50；高感（HS）：DI＞50。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病田土壤含菌量的測(cè)定結(jié)果

由20個(gè)樣點(diǎn)的土壤中休眠孢子含量（表1）可得，病田土壤中休眠孢子含量的平均值為1.6×108個(gè)／g土壤，此濃度作為接種試驗(yàn)中接種濃度的參考指標(biāo)。

表1 病田土壤中休眠孢子含量Table 1 Resting spores concentration in the field

2.2 不同接種方法對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

接種六周后，對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，按照甘藍(lán)根腫病室內(nèi)人工接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接種植株進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。從表2可以看出，3種接種方法均可使植株發(fā)病，其中菌土法接種效果最好，平均發(fā)病率為77.78%，平均病情指數(shù)為49.52；根際土壤注菌法效果次之，平均發(fā)病率為57.78%，平均病情指數(shù)為30.79；蘸根法效果較差，平均發(fā)病率為55.56%，平均病情指數(shù)僅為24.13。因此，3種接種方法中，以菌土法的接種效果最佳。

表2 不同接種方法下‘京豐一號(hào)’發(fā)病情況1）Table 2 The occurence of cabbage clubroot on‘Jingfeng 1’cabbage with different inoculation method

2.3 不同接種濃度對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

按1.2.4的方法制備的菌土，其病菌孢子含量分別為3.2×106、1.6×107、8×107、1.6×108、3.2×108和6.4×108個(gè)／g基質(zhì)，各濃度處理4種供試甘藍(lán)的結(jié)果見表3～6，各表數(shù)據(jù)顯示：（1）6種不同濃度的菌土均可使甘藍(lán)幼苗發(fā)病，對(duì)同一種甘藍(lán)材料，隨著接種濃度的升高，發(fā)病率和病情指數(shù)也隨之升高；（2）接種材料‘京豐一號(hào)’為已知高感品種［3］，當(dāng)菌土中孢子濃度為3.2×106、1.6×107和8×107個(gè)／g基質(zhì)時(shí)，平均病情指數(shù)均小于30，說明這3種接種濃度在調(diào)查時(shí)間內(nèi)不能真實(shí)地反映接種材料的抗性。

表3 不同接種濃度下‘京豐一號(hào)’發(fā)病情況Table 3 The occurence of cabbage clubroot on‘Jingfeng 1’cabbage under different inoculation concentrations

表4 不同接種濃度下‘PM’發(fā)病情況Table 4 The occurence of cabbage clubroot on‘PM’cabbage under different inoculation concentrations

表5 不同接種濃度下‘P3’發(fā)病情況Table 5 The occurence of cabbage clubroot on‘P3’cabbage under different inoculation concentrations

表6 不同接種濃度下‘3-1012’發(fā)病情況Table 6 The occurence of cabbage clubroot on‘3-1012’cabbage under different inoculation concentrations

表7為菌土中孢子濃度達(dá)1.6×108個(gè)／g時(shí)，4種供試甘藍(lán)材料各重復(fù)間病情指數(shù)，可以看出，各重復(fù)間接種結(jié)果比較穩(wěn)定；表8～10為菌土中孢子濃度為1.6×108、3.2×108、6.4×108個(gè)／g時(shí)4種不同供試甘藍(lán)材料間方差分析，可以看出，在1.6×108個(gè)／g接種濃度下，材料間F值80.95（F＞F0.01）各材料間表現(xiàn)出明顯的抗性差異，方差分析極顯著（表8）；當(dāng)菌土中孢子濃度達(dá)3.2×108和6.4×108個(gè)／g時(shí)，材料間F值分別為3.70和1.91（F＜F0.05），方差分析均不顯著（表9～10），表明在此兩種接種濃度下，材料間抗病性無明顯差異。綜上，接種濃度過高或過低都會(huì)影響鑒定結(jié)果的真實(shí)性，所以1.6×108個(gè)／g為最適接種濃度，能夠真實(shí)反映出供試材料的抗性，且能區(qū)分供試材料的抗感差異。

表7 接種孢子濃度為1.6×108 個(gè)／g時(shí)供試甘藍(lán)的病情指數(shù)1）Table 7 Disease index of the tested cabbage at inoculation concentration of 1.6×108spores per gram of substratum

表8 接種孢子濃度為1.6×108 個(gè)／g時(shí)供試甘藍(lán)的方差分析結(jié)果1）Table 8 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 1.6×108spores per gram of substratum

表9 接種孢子濃度為3.2×108 個(gè)／g時(shí)供試甘藍(lán)的方差分析結(jié)果Table 9 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 3.2×108spores per gram of substratum

表10 接種孢子濃度為6.4×108 個(gè)／g時(shí)供試甘藍(lán)的方差分析結(jié)果Table 10 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 6.4×108spores per gram of substratum

2.4 不同pH 條件對(duì)甘藍(lán)根腫病接種效果的影響

如表11所示，在pH 5.5～6.5范圍內(nèi)，植株平均病情指數(shù)均大于30，符合‘京豐一號(hào)’的抗性指標(biāo)［3］，當(dāng)pH 6.0時(shí)發(fā)病最重，平均發(fā)病率為81.11%，平均病情指數(shù)為51.58。所以適宜根腫病發(fā)病的土壤pH 在5.5～6.5之間，最佳pH 為6.0。各結(jié)果同時(shí)證明甘藍(lán)根腫病發(fā)病嚴(yán)重度與土壤酸堿性有關(guān)，在偏酸性土壤中（pH 5.5、6.0、6.5）發(fā)病重于中性土壤（pH 7.0），而中性土壤（pH 7.0）下發(fā)病又重于偏堿性土壤（pH 7.5、8）。

綜上，甘藍(lán)根腫病的最佳接種方法為菌土法，最佳接種孢子濃度為1.6×108個(gè)／g，土壤pH 偏酸性利于發(fā)病。最終確定甘藍(lán)根腫病最佳接種體系：采用菌土法，菌根與滅菌基質(zhì)以1∶10的比例混勻，用硫酸亞鐵溶液調(diào)節(jié)菌土基質(zhì)pH 為6.0，進(jìn)行接種。

表11 不同pH 的菌土對(duì)根腫病發(fā)病情況的影響Table 11 Effect of different soil pH value on occurence of cabbage clubroot

2.5 甘藍(lán)材料根腫病室內(nèi)人工接種抗性鑒定結(jié)果

為了能給甘藍(lán)抗根腫病育種提供可靠的育種材料，對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的20份甘藍(lán)材料在室內(nèi)進(jìn)行了人工接種抗性鑒定，按照甘藍(lán)根腫病室內(nèi)人工接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)（圖1）。

圖1 甘藍(lán)根腫病室內(nèi)人工接種單株病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Grade standard of cabbage clubroot on individual plant by artificial inoculation indoors

鑒定結(jié)果，如表12所示，本次供試的20份材料中，沒有免疫（I）和高抗（HR）根腫病材料，其中抗?。≧）材料有3份，分別為：P3、R、Q3；中抗（MR）材料9份，分別為：‘P1’、‘Q1’、‘Q2’、‘3-1005’、‘3-1012’、‘3-1015’、‘3-1017’、‘3-1020’、‘3-1021’；感?。⊿）材料有7份，分別為：‘PM’、‘P2’、‘P4’、‘3-1003’、‘3-1004’、‘3-1006’、‘3-1009’；高度感病（HS）材料1份：PF。

表12 甘藍(lán)種質(zhì)資源的抗根腫病篩選結(jié)果Table 12 Screening results of resistance of cabbage germplasm resources against clubroot

3 討論

建立一套穩(wěn)定的人工接種體系是抗病育種工作的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)以發(fā)病快、接種后抗／感反應(yīng)穩(wěn)定、并能正確劃分出品種真實(shí)抗性以及操作簡(jiǎn)便為宗旨，篩選出一套與田間發(fā)病癥狀吻合的最佳甘藍(lán)根腫病接種體系。

接種方法、濃度及培養(yǎng)體系pH 條件是影響植物病害抗性鑒定準(zhǔn)確性的重要因子，為建立一套可靠的甘藍(lán)根腫病接種體系，本研究針對(duì)這3種因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果表明，所采用的3種接種方法中菌土法接種效果最佳，3種接種方法的接種物都為病原菌休眠孢子，區(qū)別在于菌土法是將腫根直接攪碎后拌入基質(zhì)中進(jìn)行接種，而其他兩種方法的特點(diǎn)是將分離自腫根中的休眠孢子配成懸浮液后作為接種液。根據(jù)接種效果的優(yōu)劣，可以看出混有植物組織的病原孢子接種效果更好，推測(cè)可能是發(fā)病植株組織攪碎后的汁液可促進(jìn)休眠孢子萌發(fā)，利于其侵染，要驗(yàn)證此推測(cè)，還需要對(duì)根腫菌休眠孢子的萌發(fā)特性進(jìn)行深入研究；不同接種濃度的測(cè)試表明，相對(duì)于同一甘藍(lán)材料，接種濃度越高，發(fā)病效果越好，相對(duì)于不同接種材料，當(dāng)接種孢子濃度為1.6×108個(gè)／g時(shí)，能較好地區(qū)分出甘藍(lán)材料間的抗性，為最適接種濃度。

本次試驗(yàn)測(cè)得根腫病在偏酸性（pH 5.5～6.5）條件下發(fā)病較重，最適發(fā)病的土壤pH 為6.0。關(guān)于不同土壤pH 條件對(duì)植株發(fā)病輕重的影響，前人研究存在一定爭(zhēng)議，普遍認(rèn)為pH 5.4～6.5適宜該病發(fā)生［3，11-12］，但余漢清等［13］卻認(rèn)為土壤pH 與發(fā)病率無關(guān)。對(duì)于甘藍(lán)在偏酸性土壤中易于感病，筆者分析可能與根腫菌的萌發(fā)特性有關(guān)，根腫菌的最適宜萌發(fā)pH 為6.0～6.7［9］，因此土壤pH 在此范圍內(nèi)更利于根腫菌萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子，從而侵染植株。

田間實(shí)際發(fā)病情況要受不穩(wěn)定的環(huán)境條件影響，因此室內(nèi)篩選出的抗性材料，在實(shí)際栽培過程中是否表現(xiàn)抗病，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，此外由于本次研究?jī)H針對(duì)哈爾濱地區(qū)甘藍(lán)根腫菌菌源進(jìn)行抗性鑒定，因而，篩選出的抗性材料是否抗其他地區(qū)甘藍(lán)根腫病不得而知，還需要進(jìn)一步開展對(duì)甘藍(lán)根腫菌生理小種的研究。

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