楊佩文，番華彩，郭志祥，白亭亭，金桂梅，文孟良，李元廣，曾 莉＊

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2.云南大學(xué)，昆明 650091；3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200237）

隨著人類對環(huán)境、生態(tài)、安全、經(jīng)濟(jì)等的要求越來越高，研究開發(fā)具有良好生態(tài)行為、作用機(jī)理獨(dú)特、高效、高選擇性、結(jié)構(gòu)新型的農(nóng)藥是人們追求的目標(biāo)［1-2］。隨著20世紀(jì)80年代生物技術(shù)的興起，農(nóng)藥研究向生物與化學(xué)相結(jié)合的方向發(fā)展［3］。從天然產(chǎn)物中發(fā)掘生物活性化合物是新農(nóng)藥研究與開發(fā)的一個重要途徑，包括直接從中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥活性化合物和對天然化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造或分子修飾，進(jìn)而研究開發(fā)全新結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥品種［4-5］。目前以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物開發(fā)的殺菌劑主要有乙蒜素、惡霉靈、肉桂酸衍生物（烯酰嗎啉、氟嗎啉）、吡咯類化合物（拌種咯、咯菌腈）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、啶氧菌酯）等［6］。以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物開發(fā)的殺蟲、殺螨劑主要有氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、沙蠶毒素類似物、吡咯類、新煙堿類、保幼激素類似物、雙酰肼（蛻皮激素類似物）以及魚藤酮類似物、二烯酰胺、螺螨酯、嘧螨酯、殺蟲脒、滅螨醌等［7］。目前全世界應(yīng)用的生物源農(nóng)藥品種約30種，僅Bt制劑一個品種的年銷售額就達(dá)9.84億美元，我國開發(fā)的井岡霉素至今仍然是防治水稻紋枯病的優(yōu)秀農(nóng)藥品種［8-9］。一方面，我國是橫跨熱帶和寒帶的大國，幅員遼闊，地形多變，復(fù)雜的地形、地貌特征和氣候條件孕育和保存了大量珍貴的生物資源，為人們從微生物和動植物有效成分中篩選先導(dǎo)化合物提供了極其有利的自然條件。另一方面，隨著菌種分離、代謝產(chǎn)物的檢測及結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，為從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)全新結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物提供了有利基礎(chǔ)［10-11］。

本項目組在開展云南山地香蕉根際和內(nèi)生真菌分離及其次生代謝產(chǎn)物生物活性篩選過程中，獲得一株對香蕉枯萎病菌具有強(qiáng)拮抗作用的真菌Cordana musaeAGR0073，并利用多種色譜分離技術(shù)和分離介質(zhì)，結(jié)合常規(guī)化學(xué)方法，從菌株發(fā)酵液中分離純化獲得具有抗真菌活性的化合物單端孢菌素（trichothecin，TCN），這是首次從C.musae代謝產(chǎn)物中分離出該化合物。初步抑菌活性測定表明，單端孢菌素對香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichummusae）、香蕉小竇氏葉斑病菌（Deightoniellatorulosa）等香蕉病原真菌具有良好的抑菌活性［12］。為進(jìn)一步驗證該化合物對一些主要作物病原真菌的抑菌活性，本研究采用孢子萌發(fā)抑制法、菌絲生長速率法和田間藥效常規(guī)法，測定了其在不同質(zhì)量濃度下的農(nóng)用生物活性和田間防治效果，為該化合物的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

化合物單端孢菌素由本試驗室分離純化獲得。

1.1.2 供試病原菌

番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、玫瑰灰霉病菌（B.cinerea）、百合灰霉病菌（B.elliptica）、三七黑斑病菌（Alternariapanax）、番茄早疫病菌（A.solani）、白菜黑斑病菌（A.brassicae）、百合炭疽病菌（Colletotrichumlilii）、辣椒炭疽病菌（C.capsici）、水稻惡苗病菌（Fusariummoniliforme）、香石竹枯萎病菌（F.oxysporum）、玉米莖腐病菌（F.graminearum）、馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans）、辣椒疫病病菌（P.capsici）、玉米小斑病菌（Bipolarismaydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthegrisea），共16個作物病原真菌，由本實(shí)驗室分離培養(yǎng)保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 最低抑制濃度測定［13］

1.2.1.1 分生孢子懸浮液和游動孢子懸浮液的制備

番茄灰霉病菌、玫瑰灰霉病菌、百合灰霉病菌、三七黑斑病菌、番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌、百合炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、水稻惡苗病菌、香石竹枯萎病菌、玉米莖腐病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌等13個病原菌由PSA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，稻瘟病菌由燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)。待病原菌在培養(yǎng)基上長滿菌絲后，用無菌水洗去氣生菌絲，日光燈（400nm）照射下培養(yǎng)分生孢子，最后用無菌水洗下過濾得到分生孢子懸浮液。

馬鈴薯晚疫病菌和辣椒疫病病菌由黑麥A 培養(yǎng)基（RSA）培養(yǎng)，待菌絲長滿后，加入2～3滴無菌水后用涂布器將菌絲均勻壓平，放入溫度25 ℃培養(yǎng)箱中24h培養(yǎng)孢子囊，最后用無菌水洗下孢子囊過濾并放入4～6 ℃冰箱2h釋放游動孢子得到游動孢子懸浮液。

分生孢子懸浮液和游動孢子懸浮液濃度為10×10低倍鏡下每個視野30～40個孢子為宜。

PSA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖15g，瓊脂粉15g，蒸餾水1 000mL，pH 值自然。燕麥培養(yǎng)基：燕麥200g，蔗糖15g，瓊脂粉15g，蒸餾水1 000mL，pH 值自然。黑麥A 培養(yǎng)基（RSA）：黑麥60g，蔗糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH 值自然。

1.2.1.2 測定方法

采用凹玻片法測定單端孢菌素對供試病原真菌分生孢子和游動孢子最低抑制濃度（MIC）。將純化獲得的單端孢菌素用5%丙酮溶液配制成質(zhì)量濃度為100mg／L的母液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

初步測定時，單端孢菌素濃度分別為20、40、60、80、100mg／L，無菌水和5%丙酮溶液為對照，每處理4次重復(fù)。測定體系為100μL，孢子懸浮液和化合物溶液各50μL等體積混合。將凹玻片在28℃培養(yǎng)18 h后，顯微觀察分生孢子和游動孢子生長情況，根據(jù)顯微鏡檢結(jié)果，再分別逐步降低體系中單端孢菌素的濃度，能夠完全抑制分生孢子和游動孢子萌發(fā)的最低藥劑濃度即為MIC（即萌發(fā)率為0的最低藥劑濃度）。

1.2.2 菌絲生長抑制測定

采用平皿生長速率法［14］測定供試樣品對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒炭疽病菌、水稻惡苗病菌、馬鈴薯晚疫病菌、玉米小斑病菌和水稻稻瘟病菌等7種病菌生長的抑制效果。

1.2.2.1 藥劑配制

分別準(zhǔn)確量取1 000μg／mL 的樣品溶液10 mL，用無菌水倍比稀釋8次，分別得到濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78mg／L 的溶液，用無菌水作對照。

1.2.2.2 測定方法

取各濃度藥液10mL的分別倒入8瓶滅菌的培養(yǎng)基中（每瓶裝有90 mL 培養(yǎng)基，藥液分別被稀釋10倍），混勻后將培養(yǎng)基倒入直徑9cm 的培養(yǎng)皿，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)平板，每種濃度5個重復(fù)。用直徑5mm 的滅菌不銹鋼打孔器在已長滿菌絲的培養(yǎng)基上打孔。將菌絲塊接種于含藥平板中央，28 ℃培養(yǎng)。待對照平板上菌絲接近長滿培養(yǎng)皿時，用十字交叉法（取菌落輻射生長長軸直徑與短軸直徑的平均值減去原菌絲塊直徑）測量菌落直徑，計算藥劑的菌絲生長抑制率。

抑制率（%）＝（CK 菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）／CK 菌落平均直徑×100；

根據(jù)樣品各濃度對數(shù)值（x）及對應(yīng)的菌絲生長抑制率幾率值（y）作回歸分析，求出毒力回歸方程（y＝a＋bx）和相關(guān)系數(shù)（r），根據(jù)回歸方程計算出樣品對病菌菌絲生長抑制的EC50和95%置信區(qū)間，以此表示樣品對病菌抑制作用的強(qiáng)弱。

1.2.3 田間藥效測定

分別開展單端孢菌素防治番茄灰霉病、番茄早疫病、辣椒炭疽病、馬鈴薯晚疫病、玉米小斑病和水稻稻瘟病等6個病害的田間藥效試驗，試驗條件、試驗設(shè)計和安排、調(diào)查、記錄和測量方法等均按農(nóng)業(yè)部藥檢所“農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則”進(jìn)行［16-19］。單端孢菌素設(shè)125、250和500mg／L 3個濃度，各試驗對照藥劑濃度均為500 mg／L。番茄灰霉病對照藥劑為50%異菌脲可濕性粉劑（德國拜耳作物科學(xué)中國有限公司生產(chǎn)），番茄早疫病對照藥劑為40%菌核凈可濕性粉劑（吉林力生農(nóng)化農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)），辣椒炭疽病對照藥劑為80%代森錳鋅可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化有限公司生產(chǎn)），馬鈴薯晚疫病對照藥劑為68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)），玉米小斑病對照藥劑為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（山東樂邦化學(xué)品有限公司生產(chǎn)），水稻稻瘟病對照藥劑為75%三環(huán)唑可濕性粉劑（江蘇三山農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)），對照藥劑均為市售品。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑制濃度測定結(jié)果

單端孢菌素對16個靶標(biāo)植物病原真菌的最低抑制濃度（MIC）測定結(jié)果如表1所示。

表1 單端孢菌素對作物病原菌的MICTable 1 The minimum inhibition concentration of trichothecin to crop pathogens

測定結(jié)果顯示，單端孢菌素對供試的14個病原真菌分生孢子和2個病原真菌游動孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制活性，抑菌譜廣，對辣椒炭疽病菌和百合炭疽病菌的抑菌活性最強(qiáng)，MIC 值分別為1.9和2.2 mg／L，對玉米小斑病菌和玉米大斑病菌的抑菌活性相對較弱，MIC值分別為15.1和15.5mg／L，對番茄灰霉病菌、水稻稻瘟病菌等12個病原菌抑菌活性中等，MIC值為3.0～11.2mg／L。

2.2 菌絲生長抑制測定結(jié)果

單端孢菌素對7 個作物病原真菌毒力回歸方程及EC50值計算統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明單端孢菌素對7 個作物病原真菌菌絲生長均有較好的抑制作用，對辣椒炭疽病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為5.93 mg／L，對馬鈴薯晚疫病菌的毒力最弱，EC50為16.50 mg／L，對其余5 個病原菌毒力大小依次為番茄早疫病菌、水稻惡苗病菌、水稻稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和玉米小斑病菌，其EC50分別為7.90、9.27、10.78、13.34和14.95mg／L。番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒炭疽病菌、番茄灰霉病菌、水稻惡苗病菌、馬鈴薯晚疫病菌和玉米小斑病菌毒力回歸方程的斜率依次遞減，分別為1.450 5、1.373 8、1.355 3、1.300 6、1.083 9、1.080 9 和0.880 8，表明單端孢菌素對7 個病原菌的敏感性依次遞減。

表2 單端孢菌素對7個作物病原菌菌絲生長抑制測定統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of mycelial growth inhibition activity of trichothecin to crop pathogens

2.3 田間藥效試驗結(jié)果

單端孢菌素對6 種作物真菌病害的田間藥效試驗結(jié)果如表3、表4 所示。結(jié)果表明：單端孢菌素對供試6種作物真菌病害均有較好的防治效果，不同質(zhì)量濃度的防治效果之間差異顯著，高濃度防效明顯優(yōu)于低濃度，隨著濃度增加，防效增強(qiáng)。其中500mg／L 質(zhì)量濃度對番茄灰霉病、番茄早疫病、辣椒炭疽病、馬鈴薯晚疫病、玉米小斑病和水稻稻瘟病的防治效果分別為78.98%、81.29%、85.28%、72.42%、78.99%和72.74%，其防治效果除低于對照藥劑75%三環(huán)唑可濕性粉劑外，均高于其他對照藥劑。

3 討論

單端孢菌素是由半知真菌類等產(chǎn)毒真菌在特定條件下所產(chǎn)生的一種具有四環(huán)狀12，13-環(huán)氧骨架結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)劃分為A、B、C、D 4 種類型，其中，A、B 型較為常見［20］。該類毒素的研究僅局限于從受病害侵染的糧食產(chǎn)品中分離毒素及毒素的結(jié)構(gòu)分析，由于其廣泛的毒性效應(yīng)而應(yīng)用上受到限制［21-22］。近年來的研究表明，單端孢菌素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［23］。一定劑量的粉紅單端孢菌毒素在控制機(jī)體癌變等疑難病方面具有獨(dú)特的功效，因而已成為醫(yī)藥界一種極為重要的制藥材料［24］。此外，營金鳳［25］測定了不同寄主來源的粉紅單端孢菌株對幾種重要植物病原真菌的抑菌活性，并對粉紅單端孢對植物病原真菌的拮抗作用機(jī)制進(jìn)行了探討。Lawrence等從粉紅單端孢菌中分離獲得熱穩(wěn)定的抗菌物質(zhì)聚端孢菌素，并明確了其對真菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用［24］。本試驗研究結(jié)果表明，單端孢菌素對真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制活性，抑菌譜廣，對作物真菌和卵菌病害具有良好的防治效果。鑒于其獨(dú)特的生物活性，可通過化學(xué)結(jié)構(gòu)改造或分子修飾，降低其毒性，進(jìn)而研究開發(fā)農(nóng)藥品種，具有廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景。

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