湯亞飛，何自福＊，杜振國，佘小漫，藍(lán)國兵，羅方芳

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

番茄黃化曲葉病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)的一種重要病害，已給熱帶和亞熱帶地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［1］。田間番茄染病后表現(xiàn)為植株矮化，葉片黃化、變小，葉片邊緣向上卷曲。生長發(fā)育早期染病時(shí)，植株無法正常開花結(jié)果；后期染病，植株上部新葉表現(xiàn)癥狀，結(jié)果量減少，果實(shí)變小，失去市場價(jià)值。

番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurl virus，TYLCV）是引起全球各地番茄黃化曲葉病的主要病原之一。該病毒屬雙生病毒科（Geminiviri-dae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員，其基因組僅含A 組分（DNA-A），為單鏈環(huán)狀；該病毒由煙粉虱以持久方式傳播，同時(shí)可經(jīng)嫁接傳播，不能經(jīng)機(jī)械摩擦或種子傳毒；其寄主有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆、煙草等［2］。TYLCV 最先在以色列發(fā)現(xiàn)，之后隨著煙粉虱在全球范圍暴發(fā)而蔓延至中東、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亞洲等多個(gè)國家和地區(qū)［3］。2006年，該病毒傳入我國上海［4］，之后在浙江、江蘇、安徽、山東、河北、天津及北京等多個(gè)省市發(fā)生，造成嚴(yán)重?fù)p失［5-15］。2014年春季，湖北省武漢市田間番茄病株表現(xiàn)出嚴(yán)重的黃化、曲葉癥狀，疑似感染了雙生病毒。為了明確引起湖北省武漢市番茄黃化曲葉病的病原種類，筆者對(duì)6份病樣進(jìn)行了病原分子鑒定，對(duì)代表分離物的全基因組進(jìn)行了克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

6份疑似番茄黃化曲葉病的病葉片（編號(hào)分別為HB01～06）采自湖北省武漢市一個(gè)試驗(yàn)大棚，病株表現(xiàn)為植株矮縮，葉片皺縮、葉緣黃化；3 份陽性樣品為本實(shí)驗(yàn)室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)TYLCV 侵染性克隆注射接種發(fā)病的番茄葉片；2 份陰性樣品為本實(shí)驗(yàn)室保存的健康番茄葉片。

1.2 供試番茄樣品總DNA 提取

利用CTAB方法［16］提取各供試番茄葉片組織的總DNA。

1.3 PCR 檢測(cè)

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV 494／CoPR［17-18］，對(duì)11份供試樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4 RCA擴(kuò)增及酶切分析

隨機(jī)挑取PCR 檢測(cè)為陽性的病樣HB01 和HB02總DNA，分別取1.0μL 為模板，利用TempliPhiTMRCA Kit（GE Healthcare）進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA），以獲得病毒的全基因組。具體方法按照試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行。

RCA 反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamH I、Hind Ⅲ、PstI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為：RCA 產(chǎn)物2μL、內(nèi)切酶1μL、10×內(nèi)切酶緩沖液1μL，總酶切反應(yīng)體系為10μL。在37 ℃條件下酶切2h以上，然后進(jìn)行電泳分析。若某個(gè)內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物為2.5～3.0kb，或同時(shí)還產(chǎn)生1.3 kb左右的條帶，則克隆這些特異性條帶。

1.5 序列分析

利用DNAStar 軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）進(jìn)行序列拼接，利用BLAST 程序進(jìn)行序列相似性搜索，進(jìn)一步用DNAStar的MegAlign進(jìn)行序列比較分析，進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 5.05 的鄰接法（neighbor joining，NJ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測(cè)結(jié)果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，從6份表現(xiàn)黃化、曲葉癥狀的番茄病樣（編號(hào)分別為HB01～06）總DNA 中均擴(kuò)增到1條與陽性對(duì)照大小一致的特異片段，長度為570bp，而健康植株樣品總DNA 中未擴(kuò)增出任何片段（見圖1）。表明6份樣品中均含有菜豆金色花葉病毒屬病毒。

圖1 番茄樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection result of tomato samples

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

選取病樣HB01 和HB02 的總DNA 分別進(jìn)行RCA 和酶切反應(yīng)，結(jié)果顯示，其RCA 產(chǎn)物均能被BamH I切出1條約2.7kb大小的單一條帶。克隆和序列測(cè)定結(jié)果表明，這2 個(gè)片段序列全長均為2 781nt，且兩者的序列同源率為99.8%，即為病毒分離物DNA-A的全基因組。以HB01的全長序列代表該病毒分離物基因組，其GenBank登錄號(hào)為KJ850344。

病毒分離物HB01的基因組全長序列具有單組分菜豆金色花葉病毒屬成員基因組DNA-A 的典型特征，為單鏈閉合環(huán)狀，推導(dǎo)編碼6個(gè)ORFs。基因組病毒鏈含AV1基因（308～1 084nt，編碼CP）和AV2基因（148～498nt，編碼與病毒移動(dòng)相關(guān)蛋白），互補(bǔ)鏈含有AC1基因（1 542～2 615nt，編碼復(fù)制酶）、AC2基因（1 226～1 633nt，轉(zhuǎn)錄激活蛋白）和AC3基因（1 081～1 485nt，編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白）和AC4基因（2 171～2 464nt）。在AV2與AC1之間有一個(gè)313nt的非編碼區(qū)（位于2 616～147nt），其中含有與雙生病毒復(fù)制起始有關(guān)的保守序列TAATATTAC［19］（位于2 775～2nt）。

BLAST結(jié)果顯示，與HB01DNA-A 序列有較高同源性的序列均為TYLCV 分離物DNA-A。進(jìn)一步比較結(jié)果顯示，HB01DNA-A與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的同源性均在97%以上，其中與來自上海（TYLCV-SH2，AM282874）、浙江（TYLCV-ZJ3，AM698117）和安徽（TYLCV-AH-HB1，F(xiàn)N650807）3個(gè)分離物DNA-A的同源性最高，均為99.4%。

為了分析病毒分離物HB01與已報(bào)道的各TYL-CV 分離物的親緣關(guān)系，本文選取了來自我國不同地區(qū)的12 個(gè)分離物以及國外不同國家來源的19 個(gè)TYLCV 代表分離物，以我國臺(tái)灣番茄曲葉病毒白沙分離物（TomatoleafcurlTaiwanvirus，ToLCTWV，DQ237918）為外組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從該系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）可以看出，HB01與來自中國不同地區(qū)的12個(gè)分離物及國外的11個(gè)分離物親緣關(guān)系較近，聚在一個(gè)分支，進(jìn)一步與來自科威特的KISR分離物形成一個(gè)大的分支；而與日本Mild［Tokai］分離物、西班牙Mild［Spain7297］分離物、留尼汪島分離物、日本Sz分離物、阿巴代分離物、伊朗分離物及阿曼Tom-48分離物等7個(gè)分離物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖2 HB01與其他31個(gè)TYLCV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HB01and 31isolates of TYLCV

3 討論

雖然番茄黃化曲葉病已在我國上海、浙江、江蘇、安徽、山東、河北、河南、天津、北京、吉林、陜西、廣東、廣西、福建、海南、云南、新疆、寧夏、重慶、遼寧、甘肅、四川等20多個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）相繼發(fā)生，但對(duì)于湖北來說還是一個(gè)新病害。本文應(yīng)用RCA 方法從來自湖北的番茄病樣中擴(kuò)增獲得病毒分離物HB01的全基因組序列，該序列與國際上已報(bào)道的TYLCV各分離物同源性均在89%以上，其中與來自我國其他地區(qū)的TYLCV 分離物的同源率均在97%以上。因此，根據(jù)目前國際雙生病毒分類方案［2］，確定侵染湖北番茄的病毒分離物HB01屬于TYLCV的一個(gè)分離物，這是首次在湖北省檢測(cè)到該病毒。

自2006年Wu等［4］首次報(bào)道TYLCV入侵我國以來，該病毒已擴(kuò)散到我國20多個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)），并造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究通過比較病毒分離物基因組序列發(fā)現(xiàn)，我國各地分離物的同源性在97%以上。這說明：雖然該病毒入侵我國將近10年，但其種群的遺傳依然比較穩(wěn)定。當(dāng)然，由于該病毒在田間與其他雙生病毒存在復(fù)合侵染［20］，TYLCV是否會(huì)與其他病毒進(jìn)行重組產(chǎn)生新株系或新病毒，還需要進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。

近年來，湖北番茄栽培面積呈擴(kuò)大趨勢(shì)，尤其是高山番茄，市場效益好，發(fā)展迅速，面積逐年擴(kuò)大，現(xiàn)已成為湖北省高山蔬菜高效栽培的主要品種之一。本研究首次在湖北番茄上發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病疫情，說明該病毒也開始入侵到湖北省，應(yīng)引起有關(guān)部門和生產(chǎn)者的重視。積極采取有效的防范措施，預(yù)防與控制該病在湖北省傳播、擴(kuò)散和流行。

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