寧官保，牛藝儒，張 鼎，李宏全，馬海利，高榮琨，郝衛(wèi)芳，高文偉，趙宇軍，高詩(shī)敏，李桂蘭，李建慧，閆 芳，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西省長(zhǎng)治市畜牧獸醫(yī)局，長(zhǎng)治 046000；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；4.太原市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，太原 030024)

雞源大腸桿菌耐藥性分析及中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除作用的研究

寧官保1，牛藝儒2，張 鼎3，李宏全1，馬海利1，高榮琨1，郝衛(wèi)芳4，高文偉1，趙宇軍1，高詩(shī)敏1，李桂蘭1，李建慧1，閆 芳1，田文霞1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西省長(zhǎng)治市畜牧獸醫(yī)局，長(zhǎng)治 046000；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；4.太原市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，太原 030024)

研究雞源大腸桿菌耐藥性及中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除作用。選擇22種抗生素采用Kirby-Bauer法對(duì)山西省部分地區(qū)分離的20株致病性雞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，對(duì)分離菌株進(jìn)行質(zhì)粒分析和耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并分析多種中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除作用。結(jié)果顯示，20株試驗(yàn)菌對(duì)測(cè)試抗生素均存在不同程度的耐藥性，其中5耐及5耐以上的菌株占分離菌株的90%，試驗(yàn)菌對(duì)青霉素耐藥率最高(90%)，其次為恩諾沙星(85%)，而對(duì)黏桿菌素和呋喃妥因的耐藥性最低；分離出12種質(zhì)粒譜型，同一地區(qū)、同一雞場(chǎng)菌株的質(zhì)粒圖譜相同或相似，不同地區(qū)菌株的質(zhì)粒圖譜不同，僅有部分相同或相近的流行質(zhì)粒共存；對(duì)其中5株菌株進(jìn)行耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)同一質(zhì)?？删幋a1個(gè)至數(shù)個(gè)耐藥性基因，不同質(zhì)?？梢詳y帶相同的耐藥性基因；中藥單劑或合劑對(duì)大腸桿菌的耐藥性有一定的消除作用，其中黃芩的消除效果最好，中藥處理后部分菌株質(zhì)粒圖譜無(wú)變化，只有黃連和雙黃連造成2條質(zhì)粒帶丟失；對(duì)中藥提取物作用后的消除子進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星等多種抗生素恢復(fù)了敏感性。研究結(jié)果提示聯(lián)合使用中藥治療雞源大腸桿菌病有顯著效果。

雞；大腸桿菌；耐藥；質(zhì)粒；中藥

雞致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)是引起雞大腸桿菌病的病原體，主要導(dǎo)致病雞大腸桿菌性敗血癥、肉芽腫、心包炎、肝周炎、氣囊炎、腸炎、臍炎、全眼球炎和卵黃性腹膜炎等癥狀，并對(duì)雛雞和胚胎雞具有很高的致死性[1]。雞致病性大腸桿菌感染還可以作為雞禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎等病毒性疾病的繼發(fā)病出現(xiàn)，進(jìn)一步加劇疾病發(fā)展，對(duì)雞生命健康和養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)構(gòu)成巨大威脅[2]。伴隨著抗生素在家禽養(yǎng)殖上的過(guò)度使用或?yàn)E用，雞大腸桿菌對(duì)藥物的耐藥性不斷增加，病雞死亡率不斷提高。雞大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生涉及多種機(jī)制，其中大腸桿菌耐藥性的增加與自身耐藥質(zhì)粒的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系。而且細(xì)菌攜帶的耐藥質(zhì)粒，尤其是R質(zhì)粒，具有遺傳性，可以在不同菌株、菌種間進(jìn)行傳遞，使得耐藥性細(xì)菌持續(xù)增加、流行。研究發(fā)現(xiàn)，某些中草藥能夠消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒，起到抑制細(xì)菌耐藥性的作用[3]，這為雞大腸桿菌耐藥性的消除提供新的思路。

作者從山西省不同地區(qū)患大腸桿菌病的病雞中分離出20株致病性大腸桿菌，并挑選22種抗生素，對(duì)這些大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，試驗(yàn)提取大腸桿菌質(zhì)粒，比較各菌株質(zhì)粒譜型，揭示耐藥質(zhì)粒與大腸桿菌耐藥性的關(guān)系。在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，試驗(yàn)還研究中藥單劑或合劑對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除作用，為大腸桿菌耐藥性的消除探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

20株雞致病性大腸桿菌從山西省不同地區(qū)雞場(chǎng)送檢的病雞中分離。其中1～7號(hào)分離自臨汾市；8～10號(hào)分離自太原市；11～14號(hào)分離自太谷縣；15～16號(hào)分離自文水縣；17～20號(hào)分離自平遙縣。大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922購(gòu)自北京天壇藥物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化使用的受體菌株DH5α購(gòu)自Promega公司。

1.2 藥敏紙片

利福平(RA)、慶大霉素(GM)、黏桿菌素(PMB)、卡那霉素(K)、環(huán)丙沙星(CIP)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻肟(CTX)、氧氟沙星(OFL)、紅霉素(E)、諾氟沙星(NOR)、強(qiáng)力霉素(DO)、泰樂(lè)菌素(TL)、氟苯尼考(FF)、恩諾沙星(ENR)、氨芐西林(AM)、頭孢曲松鈉(CFX)、頭孢拉啶(CED)、呋喃妥因(NFT)、四環(huán)素(TE)、青霉素(P)、鏈霉素(S)、阿米卡星(AMK)等購(gòu)自杭州天和藥物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 中藥

大黃、黃連、黃芩、金銀花、連翹、三黃湯和雙黃連口服液均購(gòu)自太谷廣譽(yù)遠(yuǎn)中藥房。

1.4 抗菌藥物

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.5 菌株分離

雞大腸桿菌的分離、純化和鑒定參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[4-5]。

1.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行[6]。每次測(cè)定均以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922作參照。結(jié)果判定按CLSI 2008年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，級(jí)別分為耐藥(R)、中度敏感(M)和敏感(S)三種。每株菌株的藥敏試驗(yàn)均做3次重復(fù)，耐藥率取三次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.7 大腸桿菌質(zhì)粒提取及譜型鑒定

SDS堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA，凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果，并按照文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)定質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8 大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

試驗(yàn)選取耐慶大霉素的5個(gè)菌株為研究對(duì)象，提取菌株質(zhì)粒，導(dǎo)入用大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)菌，37 ℃環(huán)境LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h篩選轉(zhuǎn)化子。以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌，進(jìn)行原菌株與轉(zhuǎn)化子的耐藥性試驗(yàn)，判斷耐藥性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效果。

1.9 中藥對(duì)耐藥菌耐藥性消除試驗(yàn)

1.9.1 中藥亞抑菌質(zhì)量濃度的選擇 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，9號(hào)菌株耐藥譜最廣，達(dá)到19耐，所以中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除試驗(yàn)部分作者選擇以9號(hào)菌株為試驗(yàn)對(duì)象。所得試驗(yàn)結(jié)果用與9號(hào)菌株具有相同耐藥譜的另外兩株菌株進(jìn)行驗(yàn)證。調(diào)整9號(hào)株大腸桿菌濃度至1×104CFU·mL-1，各取100 μL加入到中草藥提取液起始質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1的2倍梯度稀釋的LB培養(yǎng)基中，一共9管，另設(shè)1管不加藥物的培養(yǎng)基作為對(duì)照。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，并判定各中藥提取物對(duì)受試菌的亞抑菌質(zhì)量濃度?；瘜W(xué)消除劑SDS的亞抑菌質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1。1.9.2 中藥單劑或合劑對(duì)雞源大腸桿菌耐藥性消除試驗(yàn) 取9號(hào)菌株液100 μL，接種于含亞抑菌質(zhì)量濃度中藥的 LB肉湯中，分別培養(yǎng) 24、48和72 h。設(shè)SDS處理組為對(duì)照組。取100 μL菌液接種于GC板，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，隨機(jī)挑選500個(gè)菌落，以影印培養(yǎng)法，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于含慶大霉素藥物質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的平板和不含藥物的普通平板上，18 h后比較各組菌落生長(zhǎng)狀況。在普通平板上生長(zhǎng)而在抗生素平板上不生長(zhǎng)的菌落即為消除子。根據(jù)消除菌落數(shù)與菌落總數(shù)，計(jì)算中藥處理后大腸桿菌耐藥性的消除率。消除試驗(yàn)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均做3次重復(fù)，最終消除率取3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。1.9.3 消除子質(zhì)粒鑒定和藥敏試驗(yàn) SDS堿裂解法提取消除子質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定譜型與相對(duì)分子質(zhì)量大小，并對(duì)中草藥作用過(guò)的消除子進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果及多重耐藥性分析

20株大腸桿菌除了對(duì)黏桿菌素和呋喃妥因完全敏感外，對(duì)其他20種抗生素均有不同程度的耐藥性，其中最少的為3耐，最多的為19耐，5耐及5耐以上的菌株占分離菌株的90%，試驗(yàn)菌未出現(xiàn)中介菌株(表1)。大腸桿菌耐藥抗生素按嚴(yán)重程度依次為青霉素、恩諾沙星、紅霉素、利福平、諾氟沙星、阿莫西林、泰樂(lè)菌素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氧氟沙星、鏈霉素、頭孢拉啶、頭孢曲松鈉、氟苯尼考、慶大霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、阿米卡星。其中青霉素、恩諾沙星、紅霉素、利福平、諾氟沙星、阿莫西林、泰樂(lè)菌素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氧氟沙星、鏈霉素的耐藥率都大于或等于50%(圖1)。

2.2 大腸桿菌耐藥菌株質(zhì)粒圖譜分析

對(duì)分離得到的20株雞源大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)。結(jié)果顯示，分離菌株的質(zhì)粒獲得率為100%，質(zhì)粒的電泳條帶最少為1條，最多為6條，質(zhì)粒為2.1×102～13.96×103bp(圖2)。不同菌株存在相同質(zhì)粒DNA電泳條帶或相同大小質(zhì)粒。對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行圖譜分析，共得到12種質(zhì)粒譜型(表2)。同一地區(qū)、同一雞場(chǎng)菌株的質(zhì)粒圖譜相同或相似，不同地區(qū)菌株的質(zhì)粒圖譜不同，但它們之間會(huì)有相同或相近的少量流行質(zhì)粒存在。

2.3 大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)對(duì)5株耐慶大霉素菌株(第7、8、9、10、16號(hào))質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化后在含有慶大霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其中2株(7、9號(hào))有少量菌落生長(zhǎng)。將這2株轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒與原供體菌質(zhì)粒進(jìn)行譜型比對(duì)，均具有相同帶型，將轉(zhuǎn)化子獲得質(zhì)粒再進(jìn)行DH5α重復(fù)轉(zhuǎn)化，均獲得一致質(zhì)粒譜型(圖3)。轉(zhuǎn)化子與原菌株對(duì)22種抗生素敏感性測(cè)定結(jié)果顯示同一質(zhì)粒可編碼1個(gè)至數(shù)個(gè)耐藥性基因，而不同質(zhì)?？梢詳y帶相同或不同的耐藥性基因。

表1 20株雞源大腸桿菌耐藥譜

Table 1 Antimicrobial susceptibility of 20E.colistrains isolated from chicken

耐藥譜數(shù)Numbers耐藥譜Antimicrobialresistancespectrum耐藥菌株數(shù)Strainnumbers3RA/DO/E14ENR/TE/P/S15RA/DO/K/TL/GM16RA/ENR/NOR/AMX/E/P410RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P110TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/TE/P/S111DO/TL/CIP/ENR/NOR/AMX/AM/E/TE/P/S111RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P/S112RA/DO/TL/FF/CIP/AMX/AM/CED/E/TE/P/S112RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AME/TE/P114RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/TE/P115RA/DO/TL/FF/ENR/NOR/AMX/AMCTX/CED/CFX/E/TE/P/S115RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/E/TE/P115DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/E/TE/P/S/GM119RA/DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/CFX/E/TE/P/S/AMK/GM/K3

圖1 20株雞源大腸桿菌耐藥率分析Fig.1 Resistance rate of E.coli(n=20)strains isolated from chicken

2.4 中藥對(duì)雞源大腸桿菌耐藥性消除作用

9號(hào)菌株用亞抑菌濃度的不同中藥處理，結(jié)果表明，各中藥提取物對(duì)大腸桿菌耐藥性均具有消除作用，且消除效率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)(24～72 h)持續(xù)上升(圖4)，其中三黃湯、雙黃連合劑對(duì)大腸桿菌耐藥性消除率高于其他中藥單劑量，而單劑中黃芩的消除效果最好。試驗(yàn)同時(shí)對(duì)與9號(hào)菌株具有相同耐藥譜的另外兩株菌株(8號(hào)和10號(hào))進(jìn)行驗(yàn)證，均得到一致結(jié)論。

2.5 消除子質(zhì)粒鑒定和藥敏試驗(yàn)

由圖5可知，9號(hào)菌株在5種中藥作用后質(zhì)粒帶無(wú)變化，經(jīng)黃連(4)和雙黃連(7)提取液作用后各丟失了2條質(zhì)粒帶(6 670和210 bp)。對(duì)中草藥作用過(guò)的消除子進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)多種抗生素恢復(fù)了敏感性，其中對(duì)CIP、ENR、OFL、NOR、AMX、AM、S、AMK、GM和K等均由耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾小?/p>

M.DL15000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～20.大腸桿菌質(zhì)粒M.DL15000 marker；1-20.plasmid of E.coli strains圖2 20株雞源大腸桿菌質(zhì)粒電泳圖譜Fig.2 Plasmid profile of 20 E.coli strains isolated from chicken

表2 20株雞源大腸桿菌質(zhì)粒譜型

Table 2 Plasmid profiles ofE.coli(n=20)strains isolated from chicken

質(zhì)粒譜型Plasmidtypes質(zhì)粒含有的堿基數(shù)/kbPlasmidbases菌株數(shù)Numbers菌株來(lái)源SourceP15.901臨汾市P27.771文水縣P38.871太谷縣P47.911.934平遙縣P56.152.710.951臨汾市P66.152.181.101臨汾市P76.342.620.951臨汾市P812.936.341.111臨汾市P912.938.036.982臨汾市P1013.936.150.951文水縣P1113.9311.356.152.273太谷縣P1212.8310.186.672.711.680.213太原市

3 討 論

大腸桿菌的耐藥性受多種因素影響，不同地區(qū)大腸桿菌耐藥種類(lèi)會(huì)有所不同，且在不同時(shí)期分離的菌株耐藥性也有較大差異[8-11]。所以對(duì)當(dāng)?shù)仉u源大腸桿菌耐藥性和耐藥譜的調(diào)查，能在一定程度上反映當(dāng)?shù)乜股厥褂们闆r，為雞大腸桿菌病的治療提供參考依據(jù)。本試驗(yàn)調(diào)查了山西省雞源大腸桿菌對(duì)各類(lèi)抗生素的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)青霉素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥性均在50%以上，其中以青霉素類(lèi)抗生素耐藥率最高；氨基糖苷類(lèi)抗生素、硝基呋喃類(lèi)抗生素和頭孢菌素類(lèi)抗生素的耐藥率較低，而對(duì)硝基呋喃類(lèi)抗生素全部敏感。這些調(diào)查結(jié)果可以為當(dāng)?shù)仉u大腸桿菌病治療用藥選擇提供很好的依據(jù)。

面對(duì)雞源大腸桿菌抗生素耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，人們將注意力轉(zhuǎn)向利用中藥來(lái)抑制大腸桿菌的耐藥性。研究指出，一些中藥提取劑具有良好的抗菌活性，并且與抗生素聯(lián)合使用時(shí)可以增強(qiáng)抗生素的抗菌活性，起到聯(lián)合治療的效果[12]。中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性的抑制與其對(duì)菌體內(nèi)耐藥性質(zhì)粒的清除有密切的關(guān)系。陳群等發(fā)現(xiàn)黃連對(duì)大腸桿菌R質(zhì)粒具有明顯的消除作用，黃連作用24 h，大腸桿菌R質(zhì)粒消除率為2.42%，48 h時(shí)，其消除率可提高為22.57%[13]。張寅晨等用連翹對(duì)導(dǎo)入含有Ampr基因質(zhì)粒的大腸桿菌作用12 h，質(zhì)粒DNA電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)連翹對(duì)大腸桿菌質(zhì)粒具有顯著消除作用[14]。最近張文平等的研究發(fā)現(xiàn)，金銀花水浸液對(duì)大腸桿菌R質(zhì)粒也有顯著的消除作用[15]。而目前還沒(méi)有關(guān)于黃芪、大黃對(duì)大腸桿菌耐藥性和質(zhì)粒消除作用研究的報(bào)道。本試驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)黃芩、大黃、金銀花、黃連、連翹等五種中藥單劑和三黃湯、雙黃連兩種方劑對(duì)雞源大腸桿菌耐藥性均表現(xiàn)出不同程度的消除效果，且中藥方劑對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除率高于單味中藥。這一結(jié)論與其他研究結(jié)果相吻合[16]。質(zhì)粒圖譜分析結(jié)果表明，只有黃連和雙黃連能引起大腸桿菌質(zhì)粒譜型的改變，其他中藥作用后質(zhì)粒帶均無(wú)變化。這提示各味中藥對(duì)大腸桿菌的抑制機(jī)制并不相同。黃連和雙黃連造成大腸桿菌6 670和210 bp兩條質(zhì)粒帶消失，推測(cè)雞大腸桿菌攜帶6 670和210 bp的質(zhì)粒介導(dǎo)了對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星等耐藥性的產(chǎn)生。黃連和雙黃連可以通過(guò)消除耐藥質(zhì)?；虻霓k法提高對(duì)大腸桿菌耐藥性的清除率。黃芪、大黃、金銀花等中藥則可能通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌耐藥性的清除，這些途徑可能涉及整合子、轉(zhuǎn)座子、染色體等遺傳物質(zhì)的改變[17]。

M.DL15000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.DH5α；2.第9號(hào)菌株；3.第9號(hào)菌的轉(zhuǎn)化子；4.第7號(hào)菌；5.第7號(hào)菌的轉(zhuǎn)化子M.DL15000 marker；1.DH5α；2.No.9 plasmid of E.coli strains；3.No.9 plasmid after transformation；4.No.7 plasmid of E.coli strains；5.No.7 plasmid after transformation圖3 耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后電泳圖譜Fig.3 Profile of isolated plasmid after transformation

圖4 不同中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除率Fig.4 The clearance rate of colony (%) different Chinese herb against resistant E.coli strains from chicken

M.DL15000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.黃芩處理；2.大黃處理；3.金銀花處理；4.黃連處理；5.連翹處理；6.三黃湯處理；7.雙黃連處理M.DL15000 marker；1.Scutellaria baicalensis treatment；2.Rheum officinale treatment；3.Honeysuckle treatment；4.Coptis chinensis treatment；5. Fructus forsythiae treatment；6.Sanhuangtang treatment；7.Shuanghuanglian treatment圖5 中草藥提取物處理后大腸桿菌質(zhì)粒電泳圖譜Fig.5 Profile of isolated plasmid after drug treatment

4 結(jié) 論

用中藥對(duì)雞大腸桿菌作用后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，大腸桿菌對(duì)多種抗生素恢復(fù)了敏感性。因此，聯(lián)合使用中藥可以提高抗生素對(duì)雞源大腸桿菌的殺滅效果，具有很好的推廣價(jià)值。

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(編輯 白永平)

Studies on the Drug Resistance of Chicken IsolatedEscherichiacoliand Role of Traditional Chinese Medicines in the Drug Resistance Elimination

NING Guan-bao1，NIU Yi-ru2，ZHANG Ding3，LI Hong-quan1，MA Hai-li1，GAO Rong-kun1，HAO Wei-fang4，GAO Wen-wei1，ZHAO Yu-jun1，GAO Shi-min1，LI Gui-lan1，LI Jian-hui1，YAN Fang1，TIAN Wen-xia1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.ChangzhiAnimalHusbandryandVeterinaryBureau，Changzhi046000，China； 3.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China； 4.TaiyuanCenterforDiseaseControlandPrevention，Taiyuan030024，China)

The aim of this study was to study the drug resistance of chicken isolatedEscherichiacoliand role of traditional chinese medicines in the drug resistance elimination.Twenty kinds ofE.coliisolated from chicken around Shanxi province were tested to determine the resistant rate to 22 kinds of antibiotic by Kirby-Bauer way，the plasmid analysis and transformation test were conducted.Based on the resistance test results to antibiotic，we also evaluated the elimination effects of several traditional Chinese medicine (TCM) extracts on the isolated chickenE.coli.The results showed that the percent ofE.coliresistant to above 5 kinds of antibiotics reached 90%.The isolatedE.coliexhibited the strongest resistant rate to Penicillin G (90%)，followed by Enrofloxacin (85%)，while exhibited the highest sensitivity to Colimycin and Furadantin.According to the plasmid analysis results，12 kinds of plasmid patterns in total were found.Plasmids collected from the near farms with each other were likely to have the similar patterns，while different types among diverse areas.The transformation test results showed that one plasmid could encode single or several resistance genes，and different plasmids could have same resistance gene as well.TCM extracts，especiallyScutellariabaicalensis，had significant elimination function to the drug resistantE.coli.Majority of the TCM treated plasmids maintain the same patterns，while two plasmids change their profiles after treating with coptis chinensis and shuanghuanglian，losing two DNA bind respectively.After all，TCM extract treatment recovered the susceptibility of chickenE.colito drugs，which support the permitted use of TCM on the chickenE.colidisease control.

chicken；Escherichiacoli；drug resistance；plasmid；traditional Chinese medicine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.019

2014-12-08

山西省自然科學(xué)基金(2014011028-1；2009011043-1)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311027-3)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31072179)

寧官保(1961-)，男，山西聞喜人，副教授，主要從事生物技術(shù)在動(dòng)物傳染病學(xué)與免疫中的應(yīng)用研究，E-mail：ningguanbao034@163.com

*通信作者：田文霞，E-mail：wenxiatian@126.com

S855.1;S852.612

A

0366-6964(2015)06-1018-08