劉 璐，李建超，劉冉冉，李慶賀，文 杰，常國斌，鄭麥青，陳國宏*，趙桂蘋*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

不同品種雞對腸炎沙門氏菌人工感染初期免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異

劉 璐1，2，李建超1，2，劉冉冉2，李慶賀2，文 杰2，常國斌1，鄭麥青2，陳國宏1*，趙桂蘋2*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

本試驗以中國地方雞種北京油雞(Beijing-You chicken，BJY)和引入蛋雞品種白來航雞(White Leghorn，WL)為試驗對象，通過人工感染腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis，SE)，研究兩個不同遺傳背景新生雛雞在接種沙門氏菌后，部分免疫指標和相關(guān)基因的變化規(guī)律，揭示兩品種雞在早期對SE感染抗性的的異同點。選擇1日齡的北京油雞和白來航雞各40只，隔離艙飼養(yǎng)，相同日糧水平條件下，兩側(cè)胸肌各注射8.7×108cfu·mL-1沙門氏菌0.5 mL，分別在攻毒后12、24、72 和144 h(12 hpi、24 hpi、72 hpi、144 hpi)測定IgY、IL-6和TNF-α血清介質(zhì)變化，熒光定量檢測血液載菌量、盲腸組織中TLR4受體、DNMT3a、DNMT3b和DNMT1甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達情況。結(jié)果表明：(1) 攻毒沙門氏菌后，北京油雞的IgY、IL-6、TNF-α血清介質(zhì)水平顯著高于白來航雞(P<0.05)；(2) 在12 hpi、24 hpi和72 hpi，血液載菌量品種間差異不顯著(P>0.05)，但在144 hpi白來航雞血液中載菌量顯著高于北京油雞(P<0.05)；(3) 在24 hpi，TLR4受體在北京油雞盲腸組織中的表達顯著高于白來航雞；北京油雞與白來航雞DNMT3a、DNMT3b和DNMT1甲基轉(zhuǎn)移酶基因在兩品種間的表達差異顯著(P<0.05)。結(jié)果提示，北京油雞和白來航雞對沙門氏菌的免疫性狀具有明顯的遺傳差異，北京油雞對沙門氏菌的抗性優(yōu)于白來航雞。

北京油雞；白來航雞；腸炎沙門氏菌；免疫性能

沙門氏菌是世界衛(wèi)生組織公布的一種重要的人畜共患病原菌，不僅能夠引起家禽的各種疾病，而且能夠通過污染的禽肉造成人類沙門氏菌的感染，直接威脅人類的健康[1]。長期以來，臨床上大量不合理的使用抗生素來預(yù)防和治療沙門氏菌，使沙門氏菌耐藥譜不斷增寬，導(dǎo)致具有多重耐藥性的沙門氏菌成為世界性腸炎最流行的致病菌之一[2]。通過提高畜禽抗病性可以減少抗生素的使用，節(jié)約飼養(yǎng)成本，同時減少畜禽產(chǎn)品的抗生素殘留。

多年來，在控制沙門氏菌的傳播、降低沙門氏菌感染等方面已展開了研究。研究發(fā)現(xiàn)，抗病力屬于中低等遺傳力的數(shù)量遺傳性狀，1周齡接種沙門氏菌和產(chǎn)蛋高峰接種沙門氏菌，其抗病力的遺傳力分別為0.2和0.38[3]。胡艷等[4]對4個品種種雞腸炎沙門菌天然感染率進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國地方肉用型雞種清遠麻雞對腸炎沙門菌的抗性較強。孫鈺[5]用鼠傷寒沙門氏菌感染壽光雞和濟寧百日雞，發(fā)現(xiàn)兩雞種抗沙門氏菌能力存在差異，濟寧百日雞的血清抗體水平和盲腸TLR4表達量均極顯著高于壽光雞。本試驗以北京油雞和白來航雞為研究對象，分析胸肌注射腸炎沙門氏菌后免疫指標和相關(guān)基因差異表達情況，旨在探究不同雞種對腸炎沙門氏菌的抗性差異，為進一步揭示沙門氏菌的作用機制奠定基礎(chǔ)，并為抗病育種提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及菌株

1日齡白來航雞和北京油雞均來自昌平北京油雞保種場，采用棉拭子法對父母代及試驗用子代進行腸炎沙門氏菌檢測，淘汰陽性個體。腸炎沙門氏菌標準株50041購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 試驗設(shè)計

白來航雞和北京油雞各40只，隔離倉中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)到12日齡，以兩側(cè)胸肌各注射0.5 mL 沙門氏菌液(8.7×108cfu·mL-1)。在12 hpi、24 hpi、48 hpi和144 hpi每個品種分別隨機選取6只稱重，無菌心采血，用于血液指標測定及血液載菌量檢測，另取盲腸置于RNA Stor (天根生化科技，北京)中，備用。

1.3 血液指標測定

對采集的血液離心，分離血清，ELISA 法檢測血清中IgY、IL-6、TNF-α。

1.4 血液載菌量的檢測

采用保潔羅生物公司的血液DNA提取試劑盒提取血液細菌DNA。按照S.X.Deng等[6]的方法對血液中的腸炎沙門氏菌量進行檢測。根據(jù)腸炎沙門氏菌50041的SdfI基因(GenBank登錄號：AF370707.1)設(shè)計引物和FAM標記的探針。引物及探針序列：上游引物：5′-TCCCTGAATCTGAGAAAGAAAAACTC-3′，下游引物：5′-TTG-ATGTGGTTGGTTCGTCACT-3′，熒光探針：5′-FAMTGCAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCTAM-RA-3′。

以3.0×108cfu為標準品，分6個梯度稀釋，制作標準品。以12 hpi、24 hpi、72 hpi和144 hpi的血液DNA為模板進行FQ-PCR，反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火延伸30 s，45個循環(huán)。

1.5 RT-PCR

采用Trizol試劑(Invitrogen)提取盲腸總RNA，經(jīng)基因組DNA污染去除處理后，總RNA溶液濃度調(diào)整為1 μg·μL-1后進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 。

表1 FQ-PCR反應(yīng)體系

Table 1 FQ-PCR reaction system

名稱Name劑量/μLDose5×PCRbuffer(Mg2+Free)5.00dNTPs(10mmol·L-1)0.75EXTaqDNA聚合酶(5U·μL-1)0.25DNA模板1.00上游引物(10mmol·L-1)0.60上游引物(10mmol·L-1)0.60Mg2+(25mol·L-1)5.00探針(4.23mol·L-1)0.80ddH2O11.00總體積Total25.00

1.6 引物設(shè)計

從GenBank上獲取紅色原雞TLR4 (Toll-like receptor 4)、DNMT1 (DNA methyltransferase 1)、DNMT3a(DNA methyltransferase 3a)和DNMT3b(DNA methyltransferase 3b)共4個候選基因以及內(nèi)參基因β-actin的mRNA序列，采用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計5對引物(表2)。經(jīng)過PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測，PCR產(chǎn)物測序鑒定。

1.7 實時熒光定量PCR

以目的基因純化回收產(chǎn)物為標準品，10倍梯度稀釋后作為模板進行標準曲線的制備。同時以盲腸組織的cDNA作為模板測定樣本的基因表達量，反應(yīng)總體積20μL：cDNA模板 1.5 μL，2×SRBRGreen master Mix 10 μL，上、下游引物(l0 μmol·L-1) 各0.6 μL，Rox reference DyeII (50×) 0.4 μL，ddH2O 6.9 μL。

表2 Q-PCR所用引物

Table 2 Primers of Q-PCR

基因Gene引物序列(5'-3')Primerssequence退火溫度/℃Tm登錄號GenBankPCR產(chǎn)物長度/bpProductsizeβ-actinF:GAGAAATTGTGCGTGACATCAR:CCTGAACCTCTCATTGCCA57NM_205518.1152TLR4F:AGTCTGAAATTGCTGAGCTCAAATR:GCGACGTTAAGCCATGGAAG60NM_001030693.1190DNMT1F:AACCGCCACAACCACTGR:GCCTGTCGGTGTTTATCC57NM_206952.1215DNMT3aF:AAAAGGGACATCTCACGCR:GCTGAACTTGGCTATCCTG55NM_001024832.1189DNMT3bF:TCGAGTTCTACCATCTGCTCAAR:TCCACTCCAGGAACCGAGAAAT60NM_001024828.1132

設(shè)無模板試劑為陰性對照。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 10 s，55～60 ℃ 32 s(具體條件見表3)，40個循環(huán)。最后制作熔解曲線收集信號的程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 15 s。分析標準曲線線性范圍及標準品實測值與換算值間的差異，每個時間點6個樣本，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，取平均值。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

相對定量結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進行處理。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的t檢驗進行分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 接種沙門氏菌后兩品種間血清介質(zhì)差異

攻毒后兩品種間血清介質(zhì)差異如圖1所示。在12 hpi，血清IL-6含量白來航雞攻毒組顯著高于北京油雞(P<0.05)，72 hpi北京油雞顯著高于白來航雞(P<0.05)。在12 hpi、24 hpi，白來航雞攻毒組血清TNF-α含量顯著高于北京油雞(P<0.05)，而72 hpi北京油雞攻毒組顯著高于(P<0.05)白來航雞，144 hpi兩品種間差異不顯著(P>0.05)。在12 hpi、24 hpi和72 hpi，北京油雞血清中IgY含量顯著高于白來航雞(P<0.05)，而144 hpi兩品種間差異不顯著(P>0.05)。除血清IgY在北京油雞中各時間點的表達量均高于白來航雞以外，血清IL-6和TNF-α在北京油雞中的12 hpi起始表達量均低于白來航雞，但在北京油雞中的表達趨勢是先上升后下降，在白來航雞中的表達趨勢是先下降后上升，在72 hpi時北京油雞IL-6和TNF-α表達量均超過白來航雞。

*.P<0.05；NS.No significance.The same as below圖1 血清介質(zhì)變化趨勢Fig.1 The change tendency of serum medium

2.2 血液載菌量

應(yīng)用探針法檢測北京油雞和白來航雞12 hpi、24 hpi、72 hpi和144 hpi 4個時間點血液載菌量的變化情況。結(jié)果如圖2所示，白來航雞的載菌量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，在72 hpi到達最低值，之后又開始上升，而北京油雞則在144 hpi達到最低值。

在12 hpi、24 hpi和72 hpi兩品種間血液載菌量差異不顯著(P>0.05)，144 hpi白來航雞血液載菌量顯著高于北京油雞(P<0.05)。

2.3 盲腸TLR4受體及甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達差異

圖2 血液載菌量變化趨勢Fig.2 The change trend of blood microbial load

攻毒后兩品種間盲腸中TLR4受體及甲基轉(zhuǎn)移酶基因差異表達分析結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，盲腸TLR4的表達量，24 hpi北京油雞攻毒組顯著高于白來航雞攻毒組(P<0.05)，而12 hpi、72 hpi和144 hpi兩者差異不顯著(P>0.05)。在72 hpi，DNMT1在北京油雞攻毒組的表達顯著高于白來航雞(P<0.05)，而其他3個時間點兩品種間差異不顯著(P>0.05)。在12 hpi、24 hpi和144 hpi，DNMT3a在北京油雞攻毒組中的表達顯著高于白來航雞(P<0.05)，而72 hpi白來航雞顯著高于北京油雞(P<0.05)。12 hpi，DNMT3b在北京油雞攻毒組的表達顯著高于白來航雞，而24 hpi白來航雞攻毒顯著高于北京油雞攻毒組(P<0.05)，但72 hpi和144 pih兩品種間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 盲腸中TLR4和甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的相對表達水平Fig.3 The relative expression level of TLR4 and methyltransferase mRNA in caecum

3 討 論

近年來，從免疫遺傳機理的角度控制腸炎沙門氏菌的傳播和流行引起越來越多的關(guān)注。眾多研究證實，巨噬細胞合成和釋放的IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子不僅能作為信號激活機體的免疫防御反應(yīng)，同時能刺激巨噬細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子，引起免疫損傷后免疫抑制。當(dāng)機體受到腸炎沙門氏菌刺激時，IL-6一定程度上反映了腸炎沙門氏菌和機體間相互作用[7]。革蘭氏陰性菌的LPS刺激機體單核巨噬細胞會產(chǎn)生TNF-α參與炎癥反應(yīng)，并在病原微生物清除中起作用[8]。IgY在體內(nèi)含量大、分布廣、維持時間長，是機體抗感染免疫的主要力量[9]，而且楊俊興等研究顯示，雞抗腸炎沙門氏菌和抗鼠傷寒沙門氏菌卵黃抗體(IgY)可以抑制相應(yīng)細菌的生長[10]。

在本研究中，兩品種雞攻毒后，北京油雞IL-6、TNF-α血清介質(zhì)表達量初始值低于白來航雞，但在攻毒后期顯著高于白來航雞。推測該結(jié)果可能受母源抗體影響，白來航雞較北京油雞有更高的IL-6、TNF-α母源抗體[5]，但是隨著時間的增長，母源抗體含量逐漸降低，受到沙門氏菌感染后，自身產(chǎn)生抗體的能力較北京油雞弱。L.Eckmann等的小鼠感染試驗表明，TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-18等細胞因子對抵御沙門氏菌的早期感染非常重要，能提高感染小鼠的存活率[11]。本研究結(jié)果顯示，北京油雞自身產(chǎn)生IL-6、TNF-α能力較白來航雞強，對沙門氏菌應(yīng)激免疫應(yīng)答迅速，同時也證明了不同品種的特異性免疫功能存在遺傳差異。北京油雞各時間點IgY明顯高于白來航雞，表明北京油雞抗感染和抗應(yīng)激強，在相同的攻毒條件下，緩解沙門氏菌引起的特異性和非特異性反應(yīng)的能力比白來航雞強。這驗證了中國地方雞種抗逆性強的優(yōu)良特性。

載菌量與雞對沙門氏菌抗性呈負相關(guān)，高的載菌量往往預(yù)示著低抗病性、低治療效果[12-15]。沙門氏菌感染后，在腸道大量繁殖，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進入血液，隨后在脾、盲腸、法氏囊等器官繁殖。感染后載菌量的變化可以反映機體對沙門氏菌先天性免疫應(yīng)答的能力和抗性[16]。載菌量的檢測方法很多，除了傳統(tǒng)的涂平板記數(shù)外，目前應(yīng)用較多的是實時熒光定量PCR(Real-time Q-PCR)檢測細菌中特異性DNA[6，17]。周麗民等[18]將Q-PCR法在檢測致病菌方面與細菌培養(yǎng)法作比較，發(fā)現(xiàn)Real-time Q-PCR法較細菌培養(yǎng)法具有準確性好、靈敏度高、特異性強和快速檢測等優(yōu)點。雷永良等[19]采用國家標準的細菌培養(yǎng)法和實時熒光定量PCR方法對食品污染物監(jiān)測中也得到了相同的結(jié)論。本研究采用qPCR的方法檢測沙門氏菌特異的DNA濃度來推測沙門氏菌的數(shù)量，從各時間點趨勢圖上可以看出白來航雞的血液載菌量高于北京油雞(P>0.05)。雞盲腸中高水平的載菌量附植與吞噬細胞活性降低以及白細胞增殖反應(yīng)下降相關(guān)[20]，因此推測兩品種的細胞免疫存在差異，北京油雞產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)的速度比白來航雞快。

TLR4作為一種跨膜信號傳遞受體，除了能識別LPS，還能識別多種配體，如內(nèi)源性配體HSP60、HSP70、HSP90等[21]。而TLR4識別LPS的信號通路主要是TLR4/MyD88/NF-kB信號通路，茍忠勇[22]研究結(jié)果表明，雞白細胞中TLR4的表達被抑制是導(dǎo)致沙門氏菌易感性增加，雞死亡的重要原因。J.R.Sadeyen等[20]利用沙門氏菌易感和抗性品系進了TLR4基因表達量的研究，在感染后第1、2、4周，抗性品系的TLR4基因表達量均高于易感性品系，同時發(fā)現(xiàn)，TLR4基因的表達量與Gal1和Gal2基因的表達呈強相關(guān)(R=0.74；R=0.64)，與IL-8、IL-18和IFN-γ等免疫相關(guān)基因存在不同程度的相關(guān)性。李鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)，雞沙門氏菌感染后，TLR4基因mRNA表達上調(diào)，TLR4基因在沙門氏菌感染中發(fā)揮重要作用。本研究初步比較了不同品種雞盲腸TLR4基因mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)北京油雞盲腸TLR4基因mRNA表達量顯著高于白來航雞，提示北京油雞TLR4基因表達及其信號通路激活可能要比在白來航雞活躍，從而導(dǎo)致兩品種間抗沙門氏菌免疫性能的差異。

DNA甲基化是真核生物基因表達調(diào)控的一種方式。通過在DNA的CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，即可抑制或關(guān)閉基因表達，催化這一過程的是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)[24]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)在家禽中分兩種，一種是從頭合成酶，包括DNMT3a和DNMT3b；另一種則是DNA甲基化維持酶DNMT1。茍忠勇[22]對腸炎沙門氏菌抗病組和易感組進行比較，發(fā)現(xiàn)，TLR4和TLR21基因的啟動子區(qū)甲基化不同，感染組雞甲基化水平顯著高于抗病組。F.Tian等[25]研究發(fā)現(xiàn)，感染馬立克氏病病毒后，馬立克氏病抗病品系6 3感染組DNAMT3a表達量低于對照組，并推斷馬立克氏病抗性可能和甲基化有關(guān)。孟紀倫[26]發(fā)現(xiàn)，H5N1禽流感病毒感染與非感染雞和鴨，攻毒組脾DNA甲基化均高于對照組。H.Xu等[27]對雞人工感染大腸桿菌MeDIP-seq測序發(fā)現(xiàn)，病理變化程度不同的雞全基因甲基化的基因不同，找到大量差異基因，其中包括IL-8、IL-2和IL-1。本研究中，兩種雛雞感染腸炎沙門氏菌后，甲基化維持酶基因DNMT1、DNMT3a表達在白來航雞低于北京油雞，DNMT3b表達白來航雞高于北京油雞，抗病和易感品種甲基轉(zhuǎn)移酶表達未得到總結(jié)性結(jié)論。L.Juan等[28]發(fā)現(xiàn)，雞在感染馬立克氏病后有很多基因啟動子區(qū)域CpG位點甲基化產(chǎn)生動態(tài)變化，且不同基因甲基化的動態(tài)變化不同。

4 結(jié) 論

通過對中國地方品種北京油雞和引進品種白來航蛋雞不同免疫性狀比較，發(fā)現(xiàn)兩品種在炎性細胞因子變化規(guī)律、血液載菌量、TLR4和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在盲腸的表達等性狀均呈現(xiàn)顯著差異。結(jié)果表明，北京油雞面對沙門氏菌應(yīng)激血清抗體和細胞免疫應(yīng)答較為迅速，TLR4基因表達及其信號通路激活活躍，初步說明了北京油雞這一地方品種抗腸炎沙門氏菌能力優(yōu)于引進白來航雞。

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(編輯 郭云雁)

Differences of Early Innate Immunity between Chicken Breeds againstSalmonellaEnteritidisInfection

LIU Lu1，2，LI Jian-chao1，2，LIU Ran-ran2，LI Qing-he2，WEN Jie2，CHANG Guo-bin1，ZHENG Mai-qing2，CHEN Guo-hong1*，ZHAO Gui-ping2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

This study was conducted to study the effect ofS.Enteritidisinfection on early immune performance between two chicken breeds(the Beijing-You chicken(BJY)，a Chinese indigenous breed，and the White Leghorn(WL)，an imported laying type breed).40 BJY chickens and 40 WL chickens on 1-day-old were reared in isolators during the same period and were challenged by intramuscular injection with 8.7×108cfu·mL-1per chick(0.5 mL) ofS.Enteritidissuspension，the concentrations of cytokines，antibodies and theS.Enteritidiscolonization level in the blood and the expression ofTLR4 and methyltransferase genes were determined in each group at 12，24，72 and 144 h after post-infection (12 hpi，24 hpi，72 hpi，144 hpi).The results showed that：(1)After challenged byS.Enteritidis，the two breeds showed significant differences in the serum antibody levels of IgY，IL-6，TNF-α，the antibody levels in BJY were higher(P<0.05)；(2) TheSEcolonization level in the blood of BJY was significantly lower than that of WL at 144 hpi (P<0.05)，while there were no differences at 12 hpi，24 hpi，72 hpi between two breeds(P>0.05)；(3) At 12 hpi the relative quantity ofTLR4 in caecum in WL chickens was higher than that in BJY chickens，while at 24 hpi BJY chickens was significantly higher than that in WL chickens(P<0.05).There were significant differences for methyltransferase genes (DNMT1，DNMT3AandDNMT3B) expression in caecum between the two breeds(P<0.05).The results demonstrated that the two breeds differed markedly in immune traits afterS.Enteritidisinfection.BJY chicken was superior than WL chickens in considering of immune index.

Beijing-You chicken；White Leghorn chicken；S.Enteritidis；immune traits

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.005

2014-11-07

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-42)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃(BE2013392)

劉 璐(1990-)，女，江蘇徐州人，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：m13051343248@163.com。劉 璐和李建超同為第一作者

*通信作者：趙桂蘋，研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，Tel：010-62816019，E-mail：zhgp0402@iascaas.net.cn；陳國宏，教授，主要從事家禽遺傳育種研究，Tel：0514-87979206，E-mail：ghchen@yzu.edu.cn

S831；S813.3

A

0366-6964(2015)06-0903-08