張?jiān)?，李耀康，王光?/p>

（大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

同型半胱氨酸誘導(dǎo)基因（Homocysteine induced gene，HCY-2）是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所在研究同型半胱氨酸處理血管平滑肌而克隆的新基因〔1-2〕，目前形態(tài)學(xué)研究證實(shí)HCY-2 表達(dá)廣泛在成年大鼠的心臟、腎臟等組織中存在〔3〕，它在畸形人胚心臟中的表達(dá)發(fā)生異?！?〕，而進(jìn)一步研究顯示在同型半胱氨酸誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞時(shí)，HCY-2的表達(dá)變化與細(xì)胞增殖改變密切相關(guān)〔5〕，但是HCY-2基因在呼吸系統(tǒng)中的表達(dá)以及HCY-2 基因表達(dá)異常與呼吸系統(tǒng)畸形的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。為探討該基因在人胚呼吸系統(tǒng)中的分布，我們探討HCY-2在正常發(fā)育的人胚呼吸道中的表達(dá)變化，以揭示HCY-2基因在人呼吸系統(tǒng)發(fā)育中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料HCY-2 抗體來(lái)源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所。正常人胚（以受精齡計(jì)算胎齡）：4～8周人胚6例（早期），3～4月人胚5例（中期），5～6個(gè)月人胚5 例（晚期），8 月以上人胚4 例（近足月）；以上人胚均取材自北京大學(xué)第三附屬醫(yī)院和平里醫(yī)院等，所有胚胎因某種原因流產(chǎn)后均已死亡。

1.2 方法

1.2.1 人胚氣管和肺的獲得 取正常發(fā)育不同時(shí)期的氣管和肺，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，以5 μm厚度進(jìn)行組織切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)ABC 法 為顯示正常發(fā)育人胚不同時(shí)期氣管和肺內(nèi)HCY-2的表達(dá)，按照免疫組織化學(xué)ABC 法進(jìn)行染色。具體步驟：0.01 M KPBS清洗5 min×3 后；0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80 mL+0.01 M KPBS 100 mL+30%過(guò)氧化氫）30 min，0.01 M PBS 清洗 5 min×3；0.3% Triton X100（30%Triton X100+0.01 M KPBS 100 mL）30 min，0.01 M KPBS 清洗 5 min×3；加入抗 HCY-2 抗體濃度為1：800（體積比），陰性對(duì)照組用PBS 代替抗HCY-2 抗體，4 ℃存放24 h；吸去抗體，0.01 M KPBS 洗5 min×3；加入0.01 M KPBS 稀釋的二抗，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS 洗5 min×3；加入ABC 復(fù)合物抗體，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS 洗5 min×3；蒸餾水迅速?zèng)_3 次；加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色；梯度酒精脫水之后，封片。

1.2.3 HCY-2 表達(dá)的半定量分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用Q-500 圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)HCY-2 在正常發(fā)育不同時(shí)期的人胚氣管和肺中的表達(dá)變化灰度值，同時(shí)測(cè)定本底值，然后換算為光密度值（OD）。每個(gè)樣本分析3 張切片，每張切片隨機(jī)隨機(jī)選取3 個(gè)視野進(jìn)行分析。各組的HCY-2 表達(dá)用（±s）表示。首先用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA 模塊進(jìn)行分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后再用Scheffle post hoc 進(jìn)行組間處理。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCY-2在胚胎時(shí)期肺內(nèi)的表達(dá)同型半胱氨酸誘導(dǎo)基因在人體胚胎肺發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其陽(yáng)性產(chǎn)物分布于肺和各級(jí)支氣管的上皮及其氣管腺的腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。見(jiàn)表1及圖1。根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度不同而呈淺黃色、黃色或者是深棕色，HCY-2在妊娠早期和妊娠中期的表達(dá)最強(qiáng)，見(jiàn)圖1A及圖1B，然后在妊娠晚期的表達(dá)下降，見(jiàn)圖1C，在近足月的人胚肺內(nèi)表達(dá)最弱，見(jiàn)圖1D，妊娠晚期和近足月組與妊娠早期和中期比較，組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 01），近足月組與妊娠晚期組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 01）。

表1 正常人胚肺內(nèi)HCY-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性物含量（±s）

表1 正常人胚肺內(nèi)HCY-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性物含量（±s）

注：與妊娠早期和中期比較**P＜0.01；與妊娠晚期比較$$P＜0.01。

發(fā)育不同時(shí)期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片數(shù)18 15 15 12檢測(cè)單位面積54 45 45 36 HCY-2/單位面積0.389±0.028 0.395±0.029 0.215±0.039**0.174±0.037**，$$

圖1 妊娠期肺內(nèi)HCY-2的表達(dá)

2.2 HCY-2在胚胎時(shí)期氣管中的表達(dá)HCY-2在人體胚胎氣管發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于氣管上皮和氣管腺腺細(xì)胞的胞漿內(nèi)，以及氣管管壁內(nèi)的透明軟骨中軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。見(jiàn)表2 及圖2）。根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度不同，HCY-2在近足月胚胎的氣管中表達(dá)最強(qiáng)，見(jiàn)圖2D，然后在妊娠早期和晚期的表達(dá)逐漸下降見(jiàn)圖2B及圖2C，在妊娠中期的人胚氣管中表達(dá)最弱，見(jiàn)圖2B，與妊娠早期比較，組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），與妊娠中期比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），近足月組與妊娠晚期組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。

表2 正常人胚氣管內(nèi)HCY-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性物含量（±s）

表2 正常人胚氣管內(nèi)HCY-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性物含量（±s）

注：與妊娠早期比較**P＜0.01；與妊娠中期比較$$P＜0.01；與妊娠晚期比較##P＜0.01。

發(fā)育不同時(shí)期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片數(shù)18 15 15 12檢測(cè)單位面積54 45 45 36 HCY-2/單位面積0.301±0.029 0.219±0.029**0.251±0.032**，$$0.344±0.027**，$$，##

圖2 妊娠期氣管內(nèi)HCY-2的表達(dá)（10×10）

3 討論

HCY-2 是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所在高濃度的同型半胱氨酸誘導(dǎo)下從大鼠血管平滑肌細(xì)胞中克隆出的 4 個(gè)新的 cDNA 序列之一〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)該基因與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，屬于凋亡基因〔6〕。HCY-2在成年大鼠的心臟、血管、肝、肺、腎臟、脊髓和腦組織中均表達(dá)〔3〕，并且在人體胚胎心臟發(fā)育的整個(gè)時(shí)期持續(xù)表達(dá)〔4〕，但是在胚胎發(fā)育時(shí)期除心臟外的其他臟器中是否表達(dá)以及是否具有作用還有待進(jìn)一步探討。

在該研究中，HCY-2在人胚氣管和肺發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，并且其表達(dá)部位主要為氣管及各級(jí)支氣管的上皮和腺上皮。李英等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)，HCY-2 在功能活躍或者增殖分裂能力強(qiáng)的細(xì)胞中高表達(dá)。而我們先前的研究結(jié)果也顯示，心肌細(xì)胞內(nèi)HCY-2的表達(dá)與心肌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)，當(dāng)在心肌細(xì)胞中HCY-2高表達(dá)時(shí)，心肌細(xì)胞的增殖率隨著HCY-2表達(dá)增高而升高，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；當(dāng)HCY-2 低表達(dá)時(shí)，心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)率與HCY-2 的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)〔5〕。在人胚氣管和肺等發(fā)育過(guò)程中，構(gòu)成氣管和肺的主要細(xì)胞數(shù)量逐漸增多時(shí)，與之相對(duì)應(yīng)的是HCY-2持續(xù)表達(dá)。因此可以推測(cè)在人胚呼吸系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，HCY-2 的表達(dá)與組成呼吸系統(tǒng)的主要組成細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有關(guān)；HCY-2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖來(lái)參與氣管和肺的發(fā)育。

在雞胚轉(zhuǎn)HCY-2 基因研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，HCY-2 基因高表達(dá)與雞胚心室、心房發(fā)育、心臟結(jié)構(gòu)紊亂、心內(nèi)膜墊缺損以及心臟組成的主要細(xì)胞心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)〔7-9〕；在培養(yǎng)的人胚心肌細(xì)胞中的研究表明，HCY-2基因的表達(dá)改變可引起心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變〔10〕。HCY-2 基因的異常表達(dá)可以引起雞胚包括異位心和心臟過(guò)小等的心血管系統(tǒng)發(fā)育異常，因此推測(cè)HCY-2是一種導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的毒性因子。在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染HCY-2基因，發(fā)現(xiàn)HCY-2 可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中具有十分重要的作用〔11-12〕。因此進(jìn)一步推測(cè)HCY-2 的表達(dá)蛋白通過(guò)引起細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)氣管和肺的發(fā)育。

陳光慧等〔6〕研究表明，HCY-2 是一個(gè)凋亡促進(jìn)基因，可以促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在我們前期的研究中，HCY-2在室間隔膜部缺損的人胚心臟中表達(dá)明顯高于正常發(fā)育的人胚心臟〔4〕，推測(cè)在心臟發(fā)育過(guò)程中HCY-2 基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡來(lái)影響心臟內(nèi)部的分隔。基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)研究發(fā)現(xiàn)HCY-2 基因與 RIP3 基因高度同源〔10〕，為 RIP3 的同源基因。RIP3基因通過(guò)激活caspase-2以引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡〔13〕。在Hela 細(xì)胞中對(duì)RIP3進(jìn)行基因沉默，第二信使cAMP和cGMP將不能夠被激活，從而使細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻，細(xì)胞失去正常的功能〔14-15〕。在人胚氣管和肺的發(fā)育中，HCY-2 的表達(dá)分別在近足月和妊娠早中期表達(dá)最高，而此時(shí)胚胎的氣管和肺的發(fā)育活躍，組織結(jié)構(gòu)改變明顯，而在妊娠中期和近足月表達(dá)最低，這個(gè)時(shí)期胚胎的氣管和肺的發(fā)育相對(duì)平穩(wěn)，因此HCY-2在人體胚胎氣管和肺的發(fā)育過(guò)程中，氣管和肺的正常結(jié)構(gòu)形成方面具有重要的作用，但是其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。首先需要獲得氣管和肺畸形的胚胎，以研究HCY-2 的表達(dá)改變；另外在動(dòng)物水平通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)使HCY-2 基因表達(dá)缺失來(lái)研究氣管和肺的發(fā)育，這樣才能夠完全闡明HCY-2在胚胎氣管和肺的發(fā)育中的作用及其機(jī)制。

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