索延樂 衛(wèi)春曉 李天麗 房大學(xué) 河南省濟源市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 459000

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是I 群冠狀病毒的成員。目前對于PEDV 感染機理方面的研究較少，2007年豬氨基肽酶(pAPN)被證實為PEDV 的功能性細胞感染受體，繼而又有研究從數(shù)量上證實增加pAPN 的密度可以增大PEDV 感染率。PEDV 基因組長為27000～33000 個核苷酸(nt)，靠近3’端5kb 區(qū)域內(nèi)有5 個主要的開放閱讀框(ORF)。編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白：S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白，位于E 基因上游的ORF 命名為ORF3，編碼一個未知功能且具有多態(tài)性的產(chǎn)物。

1 豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)

自然條件下，PEDV 通過口與鼻途徑進入豬的體內(nèi)。首先侵犯小腸集合淋巴結(jié)區(qū)，接著進入小腸黏膜上皮細胞，并在細胞內(nèi)復(fù)制繁殖，病毒由感染處向周圍廣泛擴展，直到侵及全部小腸。PEDV 主要通過直接接觸、間接接觸、飼喂被病毒污染的飼料和飲水等途徑而進行水平傳播。

PED 在世界范圍內(nèi)呈廣泛的流行，在亞洲豬場中的感染非常嚴重，各種年齡的豬都能感染發(fā)病，其死亡率也很高，尤其是哺乳仔豬。甘振磊等對2005～2007年豬的幾種病毒性腹瀉病進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PED 的感染在我國豬病毒性腹瀉病中占主導(dǎo)地位。病毒在長期進化過程中形成了適應(yīng)宿主及與宿主長期共存亡的特殊分子機制。

2 豬流行性腹瀉病毒的細胞培養(yǎng)特性

自從上世紀70年代初發(fā)現(xiàn)PEDV 以來，研究者試圖嘗試采取各種方法使病毒適應(yīng)于細胞培養(yǎng)，但均未獲得成功，這在一定程度上制約了PEDV 的研究進程。直到1988年Hofmann 等首次在培養(yǎng)基含胰酶的Vero 細胞上成功繁殖出PEDV，并認為胰酶對PEDV 纖突糖蛋白切割作用增強了病毒對Vero 細胞的感染力，此方法在PEDV 分離細胞培養(yǎng)和疫苗的研究中被廣泛應(yīng)用。此后，許多研究者對PEDV 在不同細胞系中的培養(yǎng)進行了深入研究。

目前，Vero 細胞是分離培養(yǎng)PEDV 的較為理想的細胞系，但Vero 細胞來源的不同、培養(yǎng)體系、條件的差異及毒株特性的不同對PEDV 的分離有著至關(guān)重要的影響。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者對PEDV 在Vero 細胞上的培養(yǎng)特性進行深入的研究。Hofmann 等的試驗表明，對比加胰酶培養(yǎng)PEDV 時，不加胰酶的病毒毒力會大大減弱，如此連續(xù)培養(yǎng)幾代后，引起病毒在細胞上丟失。而錢永清等通過帶毒傳代法傳至第5 代以后，在培養(yǎng)液中逐步減少胰酶，直到不加胰酶，結(jié)果培育成一株不依賴胰酶的PEDV。李樹根等將接種病料的Veto細胞單層通過改變加入胰酶量發(fā)現(xiàn)，加入含10、20、30 和60μg/mL 胰酶量的細胞維持液培養(yǎng)18～20h，均出現(xiàn)細胞病變，且含60μg/mL 胰酶量的細胞維持液的Vero 細胞培養(yǎng)物中細胞病變最明顯，可達60%。適應(yīng)含胰酶的Vero 細胞中傳12 代后，逐漸轉(zhuǎn)入不含胰酶的Vero 細胞中傳代，可連續(xù)傳19 代。

3 抗病毒天然免疫

目前普遍認為，冠狀病毒通過編碼特定蛋白來逃逸或抑制宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。PEDV 侵入細胞后，其正義單鏈基因組RNA 立即被釋放入細胞質(zhì)，翻譯產(chǎn)生2 個多聚蛋白：PP1a 和PP1ab。PP1a的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp3 編碼2 個木瓜樣蛋白酶PLP1和PLP2 結(jié)構(gòu)域。張百靈等研究發(fā)現(xiàn)，PLP1 對干擾素?zé)o拮抗作用，而PLP2 是PEDV 編碼的一種干擾素拮抗劑。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDV PLP2 與抗病毒天然免疫通路中的受體-維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)和重要調(diào)節(jié)蛋白-干擾素基因刺激子(STING)發(fā)生相互作用，并對RIG-I 和STING 具有明顯的去泛素化酶(DUB)活性，進而發(fā)揮其抑制宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)的作用。

天然免疫信號通路中重要分子和蛋白的泛素化及去泛素化修飾在天然免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。張百靈等證實，PEDV 感染細胞后不誘導(dǎo)IFN-β 產(chǎn)生，并且負調(diào)節(jié)Po1y(I：C)激活的IFN-β表達通路。由于IFN 轉(zhuǎn)錄需要活化轉(zhuǎn)錄因子NFκβ、IRF3 和AP-1 等，且最新研究發(fā)現(xiàn)，PEDV 能夠抑制IRF3 的活化，據(jù)此研究人員推測PEDV 可能是通過抑制IRF3 的活化從而負調(diào)節(jié)IFN-β表達通路。

4 功能性受體

PEDV 主要利用其S 蛋白與豬腸道細胞表面受體結(jié)合，通過膜融合侵入細胞內(nèi)，集中在豬小腸絨毛上皮細胞中復(fù)制，新生病毒通過糞便和嘔吐物排出體外。PEDV 屬于冠狀病毒群，同群的豬傳染性胃腸炎病、貓傳染性腹膜炎病毒、人呼吸道冠狀病毒229E 的細胞受體都是其宿主的氨基肽酶N（APN）。研究表明，豬可溶性APN 在體外能提高仔豬抗PEDV 抗體水平和促進PEDV 在Vero 細胞中增殖，這揭示了豬APN 對PEDV 的感染性和復(fù)制起重要作用。Eeuri 等發(fā)現(xiàn)，氨肽酶N 的密度與PEDV 感染有關(guān)系對pAPN表達少的ST 細胞表面表達pAPN，發(fā)現(xiàn)熒光檢測后，表面表達量增多的ST 細胞可以很好地被病毒感染。Hyun-M 等發(fā)現(xiàn)，有除豬氨肽酶以外的潛在功能性受體二肽基肽酶4。

5 討論

豬流行性腹瀉現(xiàn)在豬場中遲遲得不到控制，主要有以下原因?，F(xiàn)場診斷困難，缺乏有效的疫苗，免疫監(jiān)測比較困難，易在豬場中循環(huán)傳播。目前，抗PEDV 的免疫機制不是十分清楚，預(yù)防PED 廣泛應(yīng)用的免疫方法是對懷孕母豬進行免疫接種，然后通過母源抗體使仔豬獲得人工被動免疫保護。由于PEDV 具有腸道組織嗜性的特點，在抗PEDV 感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用，我國研制的TGE和PED 系列疫苗采用了豬后海穴免疫接種，此免疫接種途徑除激活體液免疫和細胞免疫外，還激活了腸道局部黏膜免疫，所以與常規(guī)免疫接種途徑相比具有更好的效果。PEDV 的研究目前還處于起步階段，良好的飼養(yǎng)管理也是必須的防控步驟，減少PED 的發(fā)生是控制生產(chǎn)上仔豬病死率的首要工作。