何宛燕，陳雨欣，于勇杰，倪 穗

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

香榧假種皮提取物的體外抗氧化活性研究

何宛燕，陳雨欣，于勇杰，倪 穗*

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

測定了香榧假種皮提取物中的總酚含量，并采用DPPH自由基清除法、β-胡蘿卜素漂白法、硫代巴比妥酸法等3種方法評(píng)價(jià)了香榧假種皮提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：香榧假種皮提取物中總酚含量為(76.67±2.06)mg/g。香榧假種皮提取物具有一定的抗氧化活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但是其抗氧化活性低于BHT和抗壞血酸。DPPH自由基清除法、硫代巴比妥法、β-胡蘿卜素漂白法等3種方法測定香榧假種皮提取物體外抗氧化活性的IC50值分別為1.55 mg/mL、2.02 mg/mL 、0.58 mg/mL。

香榧假種皮；提取物；自由基；抗氧化

自由基是人體代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，人體正常的生命活動(dòng)需要適量的自由基存在和參與[1]。但是機(jī)體內(nèi)過量的自由基積累能夠引起DNA鏈斷裂、細(xì)胞蛋白羰基化、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而引起機(jī)體衰老、癌癥等疾病的發(fā)生[2-3]。此外，食品中油脂和含脂食品的酸敗也是由自由基反應(yīng)引起的[4]。因此尋求和開發(fā)能夠清除自由基的抗氧化劑具有重要的意義。但是化學(xué)合成型抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)等對(duì)人體有毒害作用，因此尋找安全、高效的天然抗氧化物質(zhì)成為近年來研究的熱點(diǎn)。

香榧(Torreyagrandiscv. Merrillii)屬紅豆杉科(Taxaceae)榧屬(TorreyaArn.)裸子植物，第三紀(jì)孑遺植物，雌雄異株，常綠喬木，在我國浙江、安徽、江蘇、福建等省份丘陵地區(qū)均有栽培[5-6]。它是我國特有的珍稀干果和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的木本油料樹種，具有材用、藥用、果用、油用和觀賞、綠化等多種用途。香榧的種子香脆可口、營養(yǎng)豐富，含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)，種仁含油率為60%左右，其中不飽和脂肪酸含量達(dá)80%以上，具有非常高的食用價(jià)值[7]。香榧還具有殺蟲消積、潤肺化痰、滑腸消痔、健脾補(bǔ)氣、去瘀生新等功效，《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》《中國藥典》等著作對(duì)其藥用價(jià)值均有記載[8]。

香榧假種皮是香榧加工過程中的大宗棄物。據(jù)報(bào)道，香榧假種皮中富含二萜類、揮發(fā)油、木質(zhì)素、黃酮、多酚化合物等活性成分，具有開發(fā)成為植物源型抗氧化劑、抑菌劑的潛力[9-10]。查閱資料發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)對(duì)于香榧假種皮的研究主要集中在活性成分提取、化學(xué)成分鑒定等方面，而對(duì)于香榧假種皮提取物功能特性的研究卻較少。筆者曾采用超臨界CO2流體萃取香榧假種皮提取物，并采用GC-MS對(duì)其提取物成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)香榧假種皮提取物主要成分是二萜類物質(zhì)，其次為羧酸、酯類、倍半萜和單萜類物質(zhì)，但是并未對(duì)其功能特性進(jìn)行研究。本文在此研究基礎(chǔ)上，測定了超臨界CO2萃取法得到的香榧假種皮提取物中的總酚含量，采用DPPH·自由基清除法、β-胡蘿卜素漂白法(β-carotene Bleaching Assay，BCB)、硫代巴比妥酸法(Thiobarbituric Acid Reactive Substance Assay，TBARS)等方法對(duì)香榧假種皮提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為香榧假種皮的綜合利用和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

香榧假種皮：于2013年9月采自浙江寧海榧坑村香榧生產(chǎn)基地樹齡20年左右的樹上。從成熟的香榧種子上剝離下假種皮，在避光條件下自然陰干、粉碎后過篩，避光密封保存于4 ℃條件下備用。沒食子酸：Bio Basic公司；1, 1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)：日本和光純藥株式會(huì)社；β-胡蘿卜素、亞油酸、2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、福林酚、L-α-卵磷脂、十二烷基硫酸鈉等購于Sigma-Aldrich公司；2, 2偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、2-硫代巴比妥酸、抗壞血酸、無水乙醇、甲醇等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-2型超臨界CO2萃取儀：美國Applied Separations公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；L600臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香榧假種皮提取物的制備

采用超臨界CO2萃取法提取香榧假種皮提取物：稱取粉碎度40目的香榧假種皮10.0 g于萃取釜中，在靜態(tài)萃取時(shí)間20 min、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間2.5 h、萃取溫度45 ℃、萃取壓力34 MPa的條件下進(jìn)行萃取，收集萃取物，得率為22.12%±0.09%，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 香榧假種皮提取物中總酚含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的沒食子酸溶液(0.2 mg/mL)于比色管中，加入蒸餾水2 mL，再加入1 mL福林酚試劑，混勻后于黑暗處靜置5 min，加入5 mL 15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后避光放置1 h，以零管為空白，測定其在760 nm波長處吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。樣品含量的測定：取0.1 mL 0.1 mg/mL樣品于比色管中，按上述步驟添加試劑，離心后測定其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算香榧假種皮提取物中總酚含量。

1.3.3 香榧假種皮提取物體外抗氧化活性研究1.3.3.1 DPPH自由基清除法

取不同質(zhì)量濃度的香榧假種皮提取物乙醇溶液2 mL與2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30 min后在515 nm測定其吸光度，記為A1?？瞻讟佑? mL無水乙醇代替測試樣品，吸光度記為A0。以抗壞血酸和BHT作為陽性對(duì)照。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。自由基清除率按下式計(jì)算：

DPPH·自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%

1.3.3.2 β-胡蘿卜素漂白法

取0.1 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL氯仿中，加入20 mg亞油酸和1 g吐溫40，然后在45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，加入50 mL蒸餾水，立即振蕩搖勻得到乳化液。取0.2 mL不同濃度的香榧假種皮提取物乙醇溶液與4.8 mL乳化液于試管中混合，50 ℃恒溫水浴2 h，測定其在470 nm波長處吸光度。空白用0.2 mL無水乙醇代替測試樣品。以抗壞血酸和BHT作為陽性對(duì)照。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。用抑制率來表示其抗氧化能力。抑制率按下式計(jì)算：

抗氧化抑制率(%)=(AA(120)-AC(120))/(AC(0)-AC(120))×100%

式中：AA(120)為t=120 min時(shí)樣品的吸光度，AC(120)為t=120 min時(shí)空白樣的吸光度，AC(0)為t=0 min時(shí)空白樣的吸光度。

1.3.3.3 硫代巴比妥酸法

參照Kulisic等的方法，有改動(dòng)[11]。取1.1 g十二烷基硫酸鈉溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的硫代巴比妥酸溶液中，得到混合液。分別取0. 1 mL不同濃度的樣品甲醇液與0. 5 mL 10 mg/mL的卵磷脂乳濁液混合，加入50 μL 0.07 mol/L的AAPH溶液引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。隨后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的乙酸溶液和1.5 mL上述混合液，振蕩均勻后沸水浴加熱1 h，冷卻后測定其在532 nm處吸光度值，記為A1?？瞻讟佑?.1 mL甲醇代替測試樣品，吸光度值記為A0。以抗壞血酸和BHT作為陽性對(duì)照。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。抗氧化率按下式計(jì)算：

抗氧化率(%)=(A0-A1)/A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧假種皮提取物中總酚含量

多酚類化合物是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物。多酚類物質(zhì)主要有單寧、花色素、酚酸和黃酮類化合物。植物中多酚類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并具有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂、抗癌等功效[12]。按1.3.2的方法得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可以看出，線性回歸方程為y=0.012 1x+0.003 9(其中x為沒食子酸質(zhì)量濃度，mg/L，y為760 nm處吸光度值)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。經(jīng)測定，香榧假種皮提取物中總酚含量為(76.67±2.06)mg/g。

2.2 香榧假種皮提取物體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，在乙醇溶液中呈紫色，在515 nm波長處有強(qiáng)吸收值[13]。當(dāng)體系中有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被配對(duì)而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，因此可用于檢測樣品的自由基清除能力。不同濃度的香榧假種皮提取物、BHT和抗壞血酸清除DPPH自由基的能力如圖2所示。

圖2 香榧假種皮提取物的DPPH自由基清除能力

由圖2 可以看出，香榧假種皮提取物具有清除DPPH自由基的能力，且在一定范圍內(nèi)呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但是清除能力低于BHT和抗壞血酸。香榧假種皮提取物對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增加而增加。當(dāng)提取物濃度為3 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為73.78%，但是濃度超過3 mg/mL后對(duì)DPPH自由基的清除作用變化很小，在測試濃度范圍內(nèi)(1 mg/mL～5 mg/mL)最大清除率達(dá)到80.13%。香榧假種皮提取物清除DPPH自由基的IC50值約為1.55 mg/mL，BHT和抗壞血酸清除清除DPPH自由基的IC50值分別為50.07 μg/mL、6.38 μg/mL。

2.2.2 β-胡蘿卜素漂白法

β-胡蘿卜素漂白法主要用于評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中的抗氧化能力。其原理是體系中的亞油酸自動(dòng)氧化生成的自由基與β-胡蘿卜素反應(yīng)，引起β-胡蘿卜素的褪色，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，可以減緩β-胡蘿卜素漂白速率，減緩程度與樣品的抗氧化活性有關(guān)[14]。不同濃度的香榧假種皮提取物、BHT和抗壞血酸對(duì)β-胡蘿卜素漂白速率的抑制效果如圖3所示。

圖3 β-胡蘿卜素漂白法測定香榧假種皮提取物抗氧化率

由圖3可知，香榧假種皮提取物能夠抑制β-胡蘿卜素黃色的衰減，其IC50值約為0.58 mg/mL。在提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，其對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制率為72.40%，在測試濃度范圍內(nèi)(1 mg/mL～5 mg/mL)最高抑制率達(dá)到93.01%。陽性對(duì)照BHT也表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化活性，其IC50值約為19.68 μg/mL?？箟难崾枪J(rèn)的一種強(qiáng)抗氧化劑，但是在β-胡蘿卜素漂白法實(shí)驗(yàn)中卻不能抑制β-胡蘿卜素黃色的衰減。這是因?yàn)榭箟难釋儆谒苄钥寡趸瘎?，在反?yīng)體系里主要集中在水相，而脂相中的含量很低，因此沒有表現(xiàn)出抗氧化活性。這與前人的報(bào)道相符，被稱為“極性反?！爆F(xiàn)象[15]。

2.2.3 硫代巴比妥酸法

硫代巴比妥酸法是評(píng)價(jià)抗氧化劑抑制脂質(zhì)過氧化活性的方法之一。體系中的多不飽和脂肪酸和膽固醇等被自由基氧化后會(huì)產(chǎn)生丙二醛及其它次級(jí)代謝產(chǎn)物，丙二醛等在酸性環(huán)境中與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成粉紅色絡(luò)合物，在532 nm波長處有最大吸光度。當(dāng)體系中有抗氧化劑存在時(shí)，能夠抑制丙二醛的產(chǎn)生，從而降低其在532 nm波長處吸光度。不同濃度的香榧假種皮提取物、BHT和抗壞血酸的抗氧化活性如圖4所示。

圖4 硫代巴比妥酸法測定香榧假種皮提取物抗氧化率

由圖4可以看出，香榧假種皮提取物和BHT的抗氧化率隨其濃度的增加而增加。在該測試中，抗壞血酸沒有表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性。當(dāng)香榧假種皮提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，其抗氧化率為41.59%，在測試濃度范圍內(nèi)(1 mg/mL～5 mg/mL)，其抗氧化率最高為63.84%。硫代巴比妥酸法評(píng)價(jià)香榧假種皮提取物抗氧化率的IC50值約為2.02 mg/mL。BHT和抗壞血酸的IC50值約為0.84 mg/mL，10.01 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 香榧假種皮提取物中的總酚含量

對(duì)香榧假種皮提取物中的總酚含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，香榧假種皮提取物中總酚含量為(76.67±2.06)mg/g。多酚類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這是因?yàn)槠浞恿u基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成為醌類物質(zhì)，對(duì)體系中的自由基具有較強(qiáng)的捕捉能力。據(jù)報(bào)道，多種植物提取物的抗氧化活性均與其多酚類化合物含量密切相關(guān)。陳亞琪等對(duì)油茶蒲粗提取物及分級(jí)萃取各相的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明總酚含量與提取物抗氧化活性呈正相性，總酚含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)[16]。Sarikurkcu 等對(duì)穗花牡荊果實(shí)提取物抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多酚含量較高的水提物具有較高的抗氧化活性[17]。此外，研究表明水果[18]、茶葉[19]等植物性食品的抗氧化活性均與其多酚含量有關(guān)。

3.2 香榧假種皮提取物的體外抗氧化活性

DPPH自由基清除法、硫代巴比妥酸法和β-胡蘿卜素漂白法等體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明香榧假種皮提取物具有一定的抗氧化活性，但是抗氧化能力低于同等濃度的BHT和抗壞血酸。DPPH自由基清除法、硫代巴比妥法、β-胡蘿卜素漂白法等3種方法測定香榧假種皮提取物抗氧化活性的IC50值分別為1.55 mg/mL、2.02 mg/mL 、0.58 mg/mL。香榧假種皮富含酚類化合物且具有良好的抗氧化活性，這說明香榧假種皮具有開發(fā)成為天然抗氧化劑和自由基清除劑的潛力。研究香榧假種皮提取物的體外抗氧化活性，對(duì)于香榧假種皮的綜合利用和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

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The Antioxidant Activity Evaluation of the Extract fromTorreyagrandiscv. Merrillii Aril

He Wanyan, Chen Yuxin, Yu Yongjie, Ni Sui*

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This study is designed to determine the total phenolic and antioxidant activities of the extract fromTorreyagrandiscv. Merrillii Aril. The antioxidant activity of the extract was evaluated by three different test system, the DPPH free radical scavenging method (DPPH), β-carotene bleaching method (BCB) and thiobarbituric acid reactive substance assay (TBARS). It was found that the total phenolics of the extract was (76.67±2.06)mg/g. The extract of theTorreyagrandiscv. Merrillii Aril exhibited antioxidant activity when tested by each method. But the antioxidant activity of the extract was less effective than the butylated hydroxytoluene (BHT) and ascorbic acid of the equal concentration. The concentration of the extract influenced its antioxidant power, and The IC50value of three different method such as DPPH, BCB, TBARS was 1.55 mg/mL, 2.02 mg/mL, 0.58 mg/mL respectively.

Torreyagrandiscv. Merrillii Aril; extract; free radical; antioxidant activity

2015-03-24

寧波市重大(重點(diǎn))科技計(jì)劃攻關(guān)項(xiàng)目(2012C10015)；寧波市農(nóng)業(yè)科技重大專項(xiàng)(2014C11006)。

何宛燕(1994—)，女。研究方向：食品加工。E-mail:kuankuanhe@163.com

*通訊作者：倪穗(1965—)，女，教授，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail:nisui@nbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.001

S573

A

1006-9690(2015)06-0001-04