蘇 鈦，黃寧珍

(1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111；4.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

匙羹藤愈傷組織培養(yǎng)研究

蘇 鈦1,2,3，黃寧珍4

(1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111；4.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

以匙羹藤組培苗為外植體，研究莖段、莖尖和葉片以及不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織形成的影響；采用4因素4水平正交設(shè)計(jì)，用SPSS軟件其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：各種外植體誘導(dǎo)愈傷的能力不同，依次是莖段、葉片。葉片誘導(dǎo)出非胚性愈傷組織，莖段、莖尖利于誘導(dǎo)胚性愈傷組織和胚狀體；愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為84.5%，愈傷生長旺盛，分裂快，顏色為淡黃色。愈傷組織分化成苗效果最好的條件是MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，分化率達(dá)到90.6%，最佳的生根條件是1/2 MS+NAA 1.6 mg/L，生根率為100%。這為研究匙羹藤的組織的脫分化、分化以及胚狀體的形成機(jī)制提供了參考。

匙羹藤；組織培養(yǎng)；愈傷組織；正交設(shè)計(jì)

匙羹藤[Gymnemasylvestre(Retz.)Schult]，屬于蘿摩科(Asclepiadaceae)匙羹藤屬(Gymnema)，別名武靴藤、金剛藤、心服黃，在全球主要分布較于印度、非洲、印度尼西亞等地區(qū)，我國主要分布在云南、廣西、海南、浙江、福建、臺灣等地，主要攀爬生于溝邊、林緣、灌木中[1]。收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第二冊)，具祛風(fēng)止痛、生肌、消腫之功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、糖尿病、毒蛇咬傷[2]。還被收載于《印度藥典》(IP2010)[3]，近年來研究發(fā)現(xiàn)匙羹藤葉具有獨(dú)特的降血糖、降血脂、抗齲齒和抑制甜味等作用[3]?？梢?，匙羹藤無論是作為藥品還是保健品，均有較好的開發(fā)前景。關(guān)于匙羹藤的研究目前主要集中在匙羹藤的化學(xué)成分分析和藥理活性等方面，結(jié)合我們前期對匙羹藤組培快繁的研究，本文以匙羹藤無菌苗為材料,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,旨在明確不同外植體類型、不同植物生長物質(zhì)及其不同濃度組合對匙羹藤愈傷組織誘導(dǎo)的影響,期望能為匙羹藤的進(jìn)一步研究與利用提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料均來自廣西植物研究所組培室匙羹藤繼代苗，植物生長調(diào)節(jié)NAA (Naphthalene acetic acid)、2-ip[6-(△-isopenylamino)purine]、TDZ (Thidiazuron)、6-BA(6-benzylaminopurine)和KT (Kinetin)均為分析純，為上海Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 外植體及基本培養(yǎng)基對匙羹藤愈傷組織誘導(dǎo)形成的影響

取0.5～1.0 cm左右的莖段、莖尖和0.5 cm2的葉片方塊，接種在N68 附加NAA(0，0.5 mg/L)、2，4-D(0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L)的培養(yǎng)基上和MS附加2，4-D(2.0，3.0 mg/L)、NAA(0，0.5 mg/L)、BA(0.5 mg/L)的培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，20 d后觀察記錄不同外植體及不同基本培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)情況。

1.2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)初步結(jié)論，以莖段為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，考察不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及組合(2，4-D、NAA、BA、2-ip)，對匙羹藤愈傷組織誘導(dǎo)的影響，每個植物生長調(diào)節(jié)劑取4個水平(見表1)，根據(jù)L16(44)[4]正交表安排16個實(shí)驗(yàn)，20 d后觀察記錄。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑種類和水平表

1.2.3 愈傷組織分化研究

將淡黃色的分化能力強(qiáng)的愈傷組織接種于含不同植物植物生長調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基(表2)，40 d后統(tǒng)計(jì)分化率，(分化率=分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))×100%。

1.2.4 生根培養(yǎng)

將分化的3 cm左右的嫩芽切下，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根。40 d后統(tǒng)計(jì)生根率(生根率=生根苗數(shù)/接種嫩芽數(shù)×100%)。

1.2.5 煉苗及移栽

將長至7 cm以上，有3條根以上的的匙羹藤小苗打開瓶蓋，在大棚中放置5～7 d后，取出洗凈培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)中(基質(zhì)組成：菜園土與蛭石，體積比為1 ∶1)，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片、莖段等外植體及基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將匙羹藤葉片、莖段外植體接種于表2所列不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后觀察，結(jié)果表明：各種外植體誘導(dǎo)愈傷的能力不同，依次是莖段、葉片，形成的愈傷組織在形態(tài)上比較一致。葉片從切口處連續(xù)產(chǎn)生愈傷組織，最后整個外植體周圍都形成愈傷組織。莖段首先在切口處形成愈傷，在腋芽處也可形成。兩種外植體的愈傷組織初形成時都呈透明、無色或淡黃綠色，隨著愈傷組織不斷地增殖，逐漸形成白色、粘稠、不透明的愈傷組織。其中莖段形成的愈傷組織增殖最快，愈傷組織的這種形態(tài)特性也最明顯；而葉片產(chǎn)生的愈傷組織淡黃色，表面粗糙， 增殖快，大多為非胚性愈傷組織。綜合比較各個因素，后期的實(shí)驗(yàn)中主要采用葉片為外植體誘導(dǎo)非胚性愈傷組織，莖段作為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織和胚狀體。

表2 不同外植體形成愈傷的能力差異

注: “+”表示長勢一般，“++”表示生長較好，“+++”表示長勢最好。

兩種材料在只含2，4-D而不含BA的N68培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加而增大，當(dāng)2，4-D為2.0 mg/L時誘導(dǎo)率最高，莖為56%，葉為45%。往培養(yǎng)基中添加一定濃度的BA(0.5 mg/L)，愈傷的誘導(dǎo)率明顯提高，莖和葉的愈傷誘導(dǎo)率分別提高到67%和60%?？梢?，2，4-D和BA對匙羹藤愈傷的形成都非常重要，最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為2，4-D 2.0 mg/L和BA 0.5 mg/L。

在上述最佳的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和組合下，將基本培養(yǎng)基由N68換為MS后發(fā)現(xiàn)，莖和葉愈傷的誘導(dǎo)率均升高到100%?？梢?，不同的基本培養(yǎng)基對匙羹藤愈傷形成的頻率影響很大，表現(xiàn)為MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，可見匙羹藤在誘導(dǎo)愈傷組織時對大量元素的需求較高。這與當(dāng)歸的愈傷組織誘導(dǎo)不同[5-6]，可能是不同物種對營養(yǎng)的要求不同所致。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

誘導(dǎo)愈傷組織的成功與否與于培養(yǎng)條件，尤其是植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度最為重要，而外植體的選擇來源和種類對愈傷組織的誘導(dǎo)形成顯得不是那么重要[7]。在匙羹藤愈傷誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，葉片和莖段在添加了2，4-D的條件下都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但是加入其它植物生長調(diào)節(jié)劑配合能獲得更好的誘導(dǎo)效果，在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以MS為基本培養(yǎng)基，通過正交試驗(yàn)，系統(tǒng)考察了2，4-D、NAA、BA、2-iP四種植物生長調(diào)節(jié)劑對匙羹藤愈傷率和愈傷質(zhì)量的影響(表3)。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷誘導(dǎo)的影響

注：“++++”表示長勢最好，其次為“+++”表示生長較好，“++”表示長勢一般，“+”表示長勢不好。

方差分析表明 (表4)， 實(shí)驗(yàn)的4種植物生長調(diào)節(jié)劑中在設(shè)定范圍內(nèi)，只有2，4-D對愈傷的誘導(dǎo)具有顯著性影響(Sig=0.01)，其它的都無顯著性影響。

表4 愈傷誘導(dǎo)的方差分析

對2，4-D 進(jìn)行LSD多重比較表明，當(dāng)2，4-D為 3.0 mg/L時愈傷誘導(dǎo)率的均值差比其它處理高得多，但是誘導(dǎo)出的愈傷生長迅速，大多為白色，粘稠狀、絲狀、絮狀、表面光滑，水漬狀愈傷，繼代困難。當(dāng)2，4-D 2.0 mg/L時，均值差雖沒2，4-D 3.0 mg/L的大，誘導(dǎo)率沒那么高，但是，誘導(dǎo)出的愈傷生長旺盛，分裂快，顏色為淡黃色，表現(xiàn)出亢進(jìn)分裂型愈傷組織的特征，因此在誘導(dǎo)愈傷過程中，應(yīng)該采用2，4-D 2.0 mg/L。

對6-BA 進(jìn)行LSD多重比較分析表明，6-BA濃度0 mg/L和0.5 mg/L組間均值差較大，存在顯著性差異，而且在濃度為0.5 mg/L時，愈傷誘導(dǎo)最大，誘導(dǎo)愈傷大多為類型Ⅱ。因此在誘導(dǎo)培養(yǎng)時應(yīng)用6-BA 0.5 mg/L作為優(yōu)選濃度。

經(jīng)Duncan a，b 多重比較分析表明，NAA、2-iP的各個處理均處于同一個子集(Subset)中，說明在所選各個濃度處理?xiàng)l件下，愈傷誘導(dǎo)率并不表現(xiàn)出明顯差異，為非重要因素，在誘導(dǎo)愈傷時，按照重要因素取最佳值，非重要因素經(jīng)濟(jì)的原則，選用最低值。

綜合以上分析，愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為84.5%，愈傷生長旺盛，分裂快，顏色為淡黃色。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織分化的影響

考察不同激素濃度及組合(IBA和BA)對匙羹藤愈傷組織分化的影響(見表5)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BA的濃度一定時，IBA的濃度為0.05～0.1 mg/L時，能誘導(dǎo)分化，分化率隨著濃度的增加而增大；BA濃度為1.0 mg/L時，誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)率高，長勢最好。因此最佳的分化培養(yǎng)基為MS+IBA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率為90.6%。

表5 不同激素組合對根分化的影響

注：“++++”表示長勢最好，其次為“+++”表示生長較好，“++”表示長勢一般，“+”表示長勢不好。

圖1 匙羹藤不同階段生長情況

2.4 NAA對匙羹藤生根的影響

影響生根的因素很多，如外植體、光照、溫度等，但是最重要的還是植物生長調(diào)節(jié)劑，由前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)已知，NAA對匙羹藤的生根具有重要影響，因此，本實(shí)驗(yàn)添加不同濃度的NAA,其中1/2 MS+NAA1.6 mg/L的培養(yǎng)基生根最好，培養(yǎng)40 d后生根率達(dá)到100%，苗健壯(表6)。

表6 NAA對匙羹藤生根的影響

注：“++++”表示長勢最好，其次為“+++”表示生長較好，“++”表示長勢一般，“+”表示長勢不好。

2.5 煉苗和移栽

匙羹藤在生根養(yǎng)基上生根后，在大棚煉苗5～7 d，移栽到基質(zhì)上，約15 d后長出新葉。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)煉苗對成活率有很大關(guān)系。4月份煉苗成活率最高，可達(dá)100%，苗長得比較快。

3 討 論

在匙羹藤誘導(dǎo)愈傷組織時，所有外植體在不含有植物植物生長調(diào)節(jié)劑的N68、Whiter和MS基本培養(yǎng)基上均不能形成愈傷組織，只有在附加2，4-D等植物生長調(diào)節(jié)劑時，才產(chǎn)生愈傷組織?？梢姡鞴倜摲只瘜χ参锷L調(diào)節(jié)劑的需要是必不可少的，所以對植物生長調(diào)節(jié)劑的研究也是人們進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)時關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

愈傷組織是非組織化和非分化的組織，由薄壁細(xì)胞組成，通常在分化組織和器官的傷口產(chǎn)生，愈傷組織的誘導(dǎo)受培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的影響[7]。誘導(dǎo)和培養(yǎng)實(shí)際上與內(nèi)源激素和外源生長調(diào)節(jié)劑有關(guān)，通過加入不同種類和濃度的外源生長調(diào)節(jié)劑結(jié)合內(nèi)源激素，實(shí)現(xiàn)外植體到組培苗的整個過程。細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，生長素可以促進(jìn)細(xì)胞伸長，愈傷組織的形成，是分化細(xì)胞脫分化以及分生組織細(xì)胞直接分裂形成[8]。根據(jù)本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，只要有適當(dāng)濃度的2，4-D存在，即可啟動外植體的脫分化的過程、以及分生細(xì)胞的直接分裂，導(dǎo)致匙羹藤愈傷組織的產(chǎn)生和增殖，說明2，4-D是誘導(dǎo)匙羹藤愈傷組織形成的有效物質(zhì)，且相對較高濃度的2，4-D對愈傷組織的增殖更為有利。其根本原因可能是2，4-D具有生長素的活性，一方面活化匙羹藤質(zhì)膜上的ATP酶，促使細(xì)胞壁環(huán)境酸化，增加細(xì)胞壁的可塑性，另一方面，生長素促進(jìn)核的有絲分裂，有利于RNA和蛋白質(zhì)的合成，為原生質(zhì)體和細(xì)胞壁的合成提供原料，最終表現(xiàn)為加快細(xì)胞的生長，形成愈傷組織[5]，2，4-D是具有苯環(huán)的區(qū)別于吲哚乙酸等具有吲哚環(huán)和具有萘環(huán)的萘乙酸等具有生長素活性的生長素，這可能是2，4-D優(yōu)于其余生長素類在誘導(dǎo)愈傷組織方面表現(xiàn)較好的因素。這是其他種類生長素所不具備的特異性；6-BA對匙羹藤愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖有獨(dú)特的作用，這可能因?yàn)榧?xì)胞分裂素6-BA調(diào)控細(xì)胞質(zhì)分裂，它與受體蛋白結(jié)合后，調(diào)節(jié)基因活性，促進(jìn)RNA合成，加強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄和翻譯。因?yàn)?-BA存在于核糖體上，促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合，形成多核糖體，加速翻譯進(jìn)度，形成新的蛋白質(zhì)，最終表現(xiàn)為細(xì)胞的擴(kuò)大，組織增大，產(chǎn)生愈傷組織[6]。因此，相對低濃度的6-BA與2，4-D協(xié)同作用，能明顯地促進(jìn)細(xì)胞分裂，使愈傷組織快速增殖。因此，可以得出如下結(jié)論：在一定的濃度范圍內(nèi)，高濃度的2，4- D與低濃度的6-BA協(xié)同作用，能有效的促進(jìn)匙羹體愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖。而其余的生長素和細(xì)胞分裂素組合則不能有效的誘導(dǎo)匙羹藤愈傷組織的形成與增殖。這可能與2，4-D和6-BA的結(jié)構(gòu)特異性有關(guān)。

[1] 中國科學(xué)院植物研究所．中國高等植物圖鑒：第3冊[M]．北京：科學(xué)出版社，2002：861，1040．

[2] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳．廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第2冊[S]．南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社， 1992：219-222..

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[4] 張軍艦，楊善朝．SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件應(yīng)用基礎(chǔ)[M]．桂林：廣西師范大學(xué)出版社，2001：58.

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[8] 李浚明．植物組織培養(yǎng)教程[M]．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992：180.

Study on Callus Culture fromGymnemasylvestre

Su Tai1,2,3，Huang Ningzhen4

(1.Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111,China;2.Yunnan Baiyao Group Innovation and R&D Center, Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111,China; 3.Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111,China；4.Guangxi Institute of Botany，Guilin 541006, China)

UsingGymnemasylvestreas explants to study how stems, stem tips, leaves and hormone affect callus. Using 4 factors and 4 levels orthogonal to design, using SPSS to analyze results. Results displayed that all kinds of explants have different callus induction abilities, followed by stems and leaves. Leaves inducedi non-embryogenic callus. Stems and stem tips induced embryogenic callus and embryoid. The best tissue culture of callus induction is MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L, the induction rate is 84.5%, callus grown more vigorous, splinter grown faster, the color is faint yellow. The optimal medium for differentiation was MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The inducing rate was 90.6%, The optimal rooted medium was 1/2 MS+NAA 1.6 mg/L. The rooting rate was 100%. This provides reference for dedifferentiation, differentiation, embryoid formation mechanism ofGymnemasylvestreorganization.

GymnemaSylvestre; tissue culture; callus ; orthogonal designing

2014-12-28

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻0330003-1,0424008-1H)。

蘇鈦(1981—)，男(白族)，碩士，工程師，主要從事藥用植物資源與生物技術(shù)研究。E-mail：kusutai2000@aliyun.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.004

Q943.1

A

1006-9690(2015)05-0014-06