李戰(zhàn)寧，孟宏濤，閆 鯤，崔海斌，郭 義，劉 晶

EGB761對(duì)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的促凋亡作用

李戰(zhàn)寧1，孟宏濤1，閆 鯤1，崔海斌2，郭 義2，劉 晶1

目的 研究銀杏葉提取物EGB761對(duì)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的促凋亡作用。方法 EGB761干預(yù)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞后，CCK- 8 觀察 50、100 和200 mg/L不同濃度EGB761作用下VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的增殖狀況，流式細(xì)胞儀分析用AnnexinV-FITC和PI雙染檢測(cè)不同濃度EGB761對(duì)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 EGB761可抑制VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的增殖，呈濃度和時(shí)間依賴性反應(yīng)；EGB761 100 mg/L、200 mg/L干預(yù)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率分別為6.85%±0.36%和14.36%±0.23%，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論 EGB761可誘導(dǎo)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞凋亡。

EGB761；VH-64；尤文肉瘤；凋亡

銀杏葉的功能主要是化濁降脂、通絡(luò)止痛、活血化瘀、斂肺平喘等[1]，臨床上現(xiàn)階段主要用于心血管疾病的治療。德國Schwabe制藥公司于20世紀(jì)研發(fā)的產(chǎn)品EGB761及其標(biāo)準(zhǔn)的制定對(duì)銀杏葉的研究進(jìn)程產(chǎn)生了進(jìn)一步的推動(dòng)作用。EGB761 主要有效成分為黃酮苷(24%)和萜內(nèi)酯(6%)，其作用是能清除自由基，也能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性。但是其受到廣大醫(yī)學(xué)界學(xué)者普遍關(guān)注的卻是其抗細(xì)胞凋亡作用，具有巨大的臨床藥用價(jià)值[2]。因?yàn)榻陙碛袑W(xué)者研究發(fā)現(xiàn)EGB761可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)腫瘤的生長速度有一定程度的控制，借此對(duì)腫瘤產(chǎn)生一定的治療作用[3]。尤文肉瘤是一種多發(fā)于青少年的惡性腫瘤，EGB761對(duì)其作用尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬用EGB761處理VH-64尤文肉瘤細(xì)胞，觀察EGB761對(duì)腫瘤的作用，分析其作用的可能機(jī)制，為EGB761抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞購自武漢博士德生物工程有限公司；(2)EGB761(銀杏葉提取物)購自南京博瑞公司，以二甲基亞砜(DMSO)稀釋為所需濃度；(3)細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，包括Hoechst 33342 染色液、碘化丙啶PI染色液和細(xì)胞染色緩沖液；(4)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，包括膜聯(lián)蛋白V、異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(PI)和結(jié)合緩沖液；(5)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Trypsin)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將VH-64尤文肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液(全培養(yǎng)液)，置于常規(guī)條件下培養(yǎng)，保持37 ℃、飽和濕度及5% CO2。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)抑制細(xì)胞增值率 參照試劑盒所附方法，通過胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的VH-64尤文肉瘤細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為 1.0×104/ml，每孔100 μl接種于 96孔板，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。24 h后給每孔加0.5 mg/ml的 EGB761，使終質(zhì)量濃度各為50、100、200 mg/L，每個(gè)濃度需設(shè) 5 個(gè)重復(fù)孔，另外還設(shè)等量的DMSO為對(duì)照組。不同的濃度各處理 12、24、48 h后，每孔各加入CCK-8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以相同的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照并且調(diào)零，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD)值，測(cè) 3 次，取其平均值減小誤差。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長期的VH-64尤文肉瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化，接種于 6 孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h，按50、100、200 mg/L EGB761組分組處理，設(shè)DMSO對(duì)照組。處理24 h后收集VH-64細(xì)胞，調(diào)整VH-64細(xì)胞懸液濃度至1.0×105/ml，在試管中以預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，冰??；再加入5 μl AnnexinV - FITC和5 μl PI到每管VH-64細(xì)胞懸液中,混勻； 4 ℃避光條件下染色15 min；補(bǔ)加結(jié)合緩沖液490 μl并混懸細(xì)胞，然后快速用流式細(xì)胞儀來分析用藥后各組VH-64細(xì)胞凋亡的不同比例。

2 結(jié) 果

2.1 CCK- 8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 EGB761(50 mg/L)處理對(duì)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的增殖無明顯影響，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)；EGB761(100和 200 mg/L)處理 12 h、24 h、48 h則可不同程度抑制VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的增殖，其抑制作用隨濃度的升高或時(shí)間的延長而增高，并且與對(duì)照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組相比較，Dunnett’s檢驗(yàn)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度EGB761作用12 h、24 h、48 h后VH-64 細(xì)胞增殖的抑制率 (%；

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

2.2 流式細(xì)胞儀Annexin-V FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 EGB761處理24 h后各組細(xì)胞凋亡率分別為：EGB761(50 mg/L)處理組(0.41±0.11)%；EGB761(100 mg/L)處理組(6.85±0.36)%；EGB761(200 mg/L)處理組(14.36±0.23)%；DMSO對(duì)照組(0.28±0.12)%。EGB761(50 mg/L)處理后細(xì)胞凋亡率無明顯變化，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。EGB761(100、200 mg/L)處理則增高了VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的凋亡率，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01；圖1 C、D)。結(jié)果顯示，隨著濃度的增高細(xì)胞凋亡率也隨之增高，表明兩者有一定的劑量依賴性。

圖1 不同濃度EGB761作用VH-64細(xì)胞24h后的凋亡檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

尤文肉瘤是嚴(yán)重危害兒童和青少年健康的惡性腫瘤之一，單純的手術(shù)、放療或化療效果并不理想，采用包含藥物在內(nèi)的綜合療法是較好的選擇。為了篩選新的抗尤文肉瘤藥物，本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了從銀杏葉制備的主要有效成分為黃酮苷和萜內(nèi)酯的EGB761對(duì)VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的作用，初步證明該藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。

已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，EGB761能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。銀杏葉總黃酮對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。其機(jī)制可能與銀杏總黃酮有清除氧自由基的活性有關(guān)[4]。另外還有實(shí)驗(yàn)證明，EGB761的有效成分黃酮類化合物通過抑制女性乳腺癌和男性前列腺癌細(xì)胞FAS表達(dá)，可以使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)脂肪合成障礙，從而導(dǎo)致腫瘤生長速度受限，凋亡比例增加[5]；也有報(bào)道顯示，EGB761可以促進(jìn)P53 基因表達(dá)升高而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤的作用[6，7]。細(xì)胞凋亡是生命的基本特征之一，而腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡受阻有密切關(guān)系[8]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的EGB761以不同的時(shí)長處理VH-64尤文肉瘤細(xì)胞，結(jié)果表明，EGB761對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞增殖也有較強(qiáng)的抑制作用，并且抑制過程中有明顯的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，而且與處理時(shí)長關(guān)聯(lián)，呈現(xiàn)劑量依賴效果。這些結(jié)果說明EGB761用于治療尤文肉瘤有較好的前景，也進(jìn)一步說明EGB761有較廣泛的抗癌譜。

EGB761可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示我們EGB761用于抑制尤文肉瘤是一個(gè)可能的選擇。鑒于本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞系之間可能有所差異，筆者下一步將采用VH-64尤文肉瘤細(xì)胞以外的尤文肉瘤細(xì)胞系來進(jìn)一步驗(yàn)證EGB761對(duì)尤文肉瘤的效果，并探索其具體的應(yīng)用方法和劑量。

除了可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，EGB761還可通過其他途徑抗腫瘤。Watari等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，EGB761抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和抑制腫瘤血管的形成而實(shí)現(xiàn)，這是因?yàn)槟[瘤的發(fā)生與體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生以及清除障礙有關(guān)[9]。而Redondo等[10,11]發(fā)現(xiàn)EGB761可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞線粒體脫氫酶的活性和中性粒細(xì)胞過氧化酶的釋放，從而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞的免疫功能進(jìn)行抗腫瘤，而且其抑制作用具有時(shí)間、濃度的依賴性。EGB761抑制VH-64尤文肉瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡是否與這些途徑有關(guān)，還有待下一步研究。

尤文肉瘤危害性較大，其發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系。所以篩選能夠促使尤文肉瘤凋亡的高效藥物，將可為抗擊尤文肉瘤提供一種有效的臨床治療方法。本實(shí)驗(yàn)初步證明，從銀杏葉提純的EGB761能明顯抑制VH-64尤文肉瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，從而為該腫瘤的臨床治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

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(2014-12-09收稿 2015-02-20修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Effection of EGB 761 to apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cellinvitro

LI Zhanning1, MENG Hongtao1, YAN Kun1,CUI Haibin2,GUO Yi2, and LIU Jing1.

1.Medical Department, Shanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054,China; 2. Hygiene Division of Logistics Department, Shanxi Provincial Corps of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054,China

Objective To explore the contribution of EGB761 to the proliferation and apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cell in vitro. Methods CCK-8 assay was used to measure 50，100 and 200 mg/L which its effects on the proliferation of Ewing’s sarcoma VH-64 cell cultured with different concentrations of allicin for 12 h, 24 h, 48 h, AnnexinV-FITC and PI assay by flow cytometer (FCM) were applied to detect the apoptosis induced by EGB761. The changes of cell cycle were detected by FCM. Results EGB761 suppressed the proliferation of Ewing’s sarcoma VH-64 cell in a concentration-and time-dependent manner EGB761 induced cellular apoptosis of the Ewing’s sarcoma VH-64 cell in a concentration-dependent manner. With EGB761 100, 200 mg/L intervention Ewing’s sarcoma VH-64 cell, flow cytometer (FCM) test showed that the cell apoptosis rate were 6.85%±0.36% and 14.36%±0.23%,which were significant higher than that of control group (P< 0.01). Conclusions EGB761 significantly suppresses the growth of Ewing’s sarcoma VH-64 cell, induces the apoptosis of Ewing’s sarcoma VH-64 cell. Therefore resveratrol may be considered as a possible treatment medicine for Ewing’s sarcoma.

EGB761;VH-64 cell; Ewing’s sarcoma;apoptosis

李戰(zhàn)寧，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：lizhanning316@126.com

1.710054 西安，武警陜西總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)務(wù)處；2.710054 西安，武警陜西總隊(duì)后勤部衛(wèi)生處

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